3.6. 反應機制

Acd_DPN7 的脫亞磺酰反應被描述為不依賴于人工電子受體。因此，這表明 FAD 在反應過程中不參與電子轉移。盡管如此，在先前的研究中不能排除氧氣作為電子受體的可能性，因為反應是在有氧條件下進行的。因此，如 §2 所述，進一步研究了 Acd_DPN7 的氧依賴性。Acd_DPN7 在存在或不存在 O2 的情況下，反應速度沒有顯著差異。此外，使用氧微呼吸傳感器測定反應混合物的氧含量，清楚地表明在脫亞磺酰反應過程中沒有消耗 O2。這些結果證實氧氣在 Acd_DPN7 反應期間不作為電子受體。結合先前研究的結果，可以得出結論，FAD（完全氧化形式或半醌形式）在脫亞磺酰反應過程中沒有被還原為 FADH2（氫醌形式），這將需要隨后的電子轉移來再生 FAD。事實上，當 FAD 輔因子被還原為 FADH2 時，Acd_DPN7 仍然可以催化脫亞磺酰反應。用連二亞硫酸鈉還原輔因子后，含有 FADH2 的 Acd_DPN7 顯示出約 76% 的 Acd_DPN7 活性。

一些黃素酶催化沒有凈氧化還原變化的反應，其中黃素作為電子供體和親核試劑或作為堿，調節蛋白質環境的反應性以執行新的反應。在分支酸合酶催化的反應中，在 C-O 鍵斷裂后，黃素可能作為堿/H 原子提取劑用于 C-H 鍵裂解。在 UDP-半乳吡喃糖變位酶中，黃素作為親核試劑攻擊半乳糖的異頭碳原子。相比之下，II 型異戊烯二磷酸異構酶采用新穎的雙黃素功能，它既作為酸又作為堿。在烷基二羥基丙酮磷酸合酶和 UDP-半乳吡喃糖變位酶中，黃素輔因子作為分子支架，在催化過程中保持中間體，以允許與第二個底物相互作用。還原形式相對于氧化形式的活性降低 24% 是顯著的，并可能指向一種機制，即在 Acd_DPN7 的情況下，FAD 的 N5 原子可能作為弱堿，作用于 3-亞磺酰丙酰基 3 位的氫，作用于亞磺酰丙酰基本身，或作用于水分子以準備親核攻擊。輔酶 A 部分和 FAD 之間的相互作用也可能有助于底物的正確定位。酶促反應（圖 6）可能通過 Arg84 的胍陽離子與 3SP-CoA 之間形成氫鍵和電荷轉移而進行，這將有利于水分子對亞磺酰基 S 原子的親核攻擊。理論上，在水溶液化研究中已經證明了胍/胍陽離子與陰離子復合物之間的氫鍵形成和電荷轉移。

3.7. 酰基輔酶 A 脫氫酶向脫亞磺酰酶的進化

突變酶 Acd_DPN7_R84K 完全喪失了其酶活性（表 3），表明 Arg84 在催化中起著重要作用。此外，在每種新型脫亞磺酰酶的一級序列中都發現了與 Acd_DPN7 中 Arg84 位置相對應的精氨酸殘基。在酰基輔酶 A 脫氫酶中，在相當于 Acd_DPN7 位置 84 的三維結構中最常出現的殘基是 Thr（四次）、Val（三次）、Ser（三次）、Leu（兩次）、Ala（一次）和 Ile（一次）（表 2）。在 Acd_DPN7 中，編碼 Arg84 的密碼子被發現是 CGA，這使得一個 Leu 殘基 (CTA) 可能通過另一個單點突變進化為 Arg，從而通過總共三個點突變（位置 84，Leu 到 Arg；位置 246，Glu 到 Gln；位置 366，Ala 到 Gly）將脫亞磺酰酶與異戊酰輔酶 A 脫氫酶聯系起來。三維結構比較和針對脫亞磺酰酶提出的系統發育樹確實將 Acd_DPN7 與人類異戊酰輔酶 A 脫氫酶相關聯。可以得出結論，Acd_DPN7 通過失去 246 位或 366 位的 Glu 殘基，并在 84 位獲得一個 Arg 作為關鍵修飾，而成為脫亞磺酰酶。

Acd_DPN7 Arg84 在空間上等同于人類戊二酰輔酶 A 脫氫酶的 Ser95（結核分枝桿菌戊二酰輔酶 A 脫氫酶的 Ser103），如三維比對所示。在人類戊二酰輔酶 A 脫氫酶的 94 位（結核分枝桿菌戊二酰輔酶 A 脫氫酶的 102 位）存在一個精氨酸，這使得與 Acd_DPN7 Arg84 的關聯是合理的。人類和結核分枝桿菌戊二酰輔酶 A 脫氫酶與 Acd_DPN7 之間的序列比對顯示，該殘基偏移了一個殘基，即它不在相同的一級位置上嚴格保守。同樣在空間上，Acd_DPN7 Arg84 被發現距離 FAD 異咯嗪環約 4 ?，比某些戊二酰輔酶 A 脫氫酶中保守的 Arg 殘基（距離 FAD 異咯嗪環約 9.5 ?）更靠近 FAD 約 5.5 ?（圖 7）。

這兩個精氨酸殘基在脫氫酶空腔內的不同定位可以解釋為對底物非輔酶 A 部分不同長度的適應。戊二酰部分有五個 C 原子，而亞磺酰丙酰部分有三個 C 原子加一個 S 原子。兩個鄰近位置上的相同殘基似乎在相同的支架內服務于不同的酶促反應（脫羧與脫亞磺酰）。在戊二酰輔酶 A 脫氫酶中，Arg94 對底物結合沒有主要貢獻，但其電場可以穩定反應中間體。在人類戊二酰輔酶 A 脫氫酶中，Arg94Gly 和 Arg94Leu 是致病性突變。在脫亞磺酰酶 Acd_DPN7 中，Arg84 的胍陽離子可能通過 NH2 和 NH 基團作為強氫鍵供體發揮作用。

4. 結論

Acd_DPN7 是首個報道的具有酰基輔酶 A 脫氫酶折疊的脫亞磺酰酶。天然 Acd_DPN7 和浸泡了琥珀酰輔酶 A 作為結構底物類似物的天然 Acd_DPN7 的結構顯示了底物與結合空腔內殘基之間的相互作用，從而允許對具有酰基輔酶 A 脫氫酶支架的這種新型脫亞磺酰酶的脫亞磺酰反應機制提出假設。總的來說，Acd_DPN7 的結構表征表明，酰基輔酶 A 脫氫酶支架具有適應性，可以適應催化作為脫亞磺酰酶的新反應，并擴展了我們對細菌脫亞磺酰途徑的理解。這些結構研究和生化數據有助于形成一個機制性提議，這絕不是完整的，但為對這種脫亞磺酰反應進行更廣泛的研究提供了基礎。