摘要：氧化石墨烯（GO）是一種廣泛使用的碳質納米材料。迄今為止，天然有機質（NOM）對GO在水生脊椎動物中毒性的影響尚未見報道。在斑馬魚胚胎發生過程中，GO誘導了顯著的孵化延遲和心包水腫。GO與卵膜的強烈相互作用導致卵膜突起損傷、過量羥基自由基（·OH）的產生以及蛋白質二級結構的改變。相比之下，腐殖酸（HA）作為NOM的一種普遍形式，顯著減輕了上述不利影響。HA減少了GO與卵膜之間的相互作用，并通過調節GO的形態、結構和表面負電荷來減輕卵膜損傷。HA還改變了GO的吸收和沉積，并減少了GO在胚胎卵黃細胞和深層細胞中的聚集。此外，HA減輕了GO誘導的線粒體損傷和氧化應激。這項工作揭示了在NOM存在下GO的一種可行的解毒機制，并避免高估GO在自然環境中的風險。


引言


氧化石墨烯（GO）作為石墨烯家族納米材料的代表，因其優異的性能和可大規模低成本生產而在環境應用中引起了廣泛關注，例如作為廢水和飲用水處理的吸附劑、水體有機染料的催化劑、固相萃取的功能材料以及脫鹽膜。GO的上述應用使其不可避免地釋放到水環境中。體外和體內數據均表明GO可能誘導毒理學效應（包括遺傳毒性和細胞毒性），GO釋放到生態系統中無疑增加了其環境風險。一些研究人員提到了在有機抗氧化劑（例如抗壞血酸和多酚）存在下GO類材料毒性的變化。天然有機質（NOM）是水環境的重要組成部分，納米材料與NOM的相互作用將是決定其在環境中歸宿的主要因素。與抗壞血酸和多酚相比，腐殖酸（HA）作為NOM的主要成分，含有親水基團，具有顯著調節納米材料環境行為和毒性的能力。盡管關于HA對碳納米管毒性影響的了解甚少，但已有研究表明，由于C60的尺寸效應和表面電荷變化，HA能減少大型溞和斑馬魚對富勒烯（C60）的吸收。類似地，由于HA的吸附，CeO2納米顆粒對秀麗隱桿線蟲的毒性降低。然而，HA吸附增加了TiO2納米顆粒在水體中的懸浮穩定性和停留時間，從而增加了對自由游動水生生物的暴露和毒性。此外，HA在水環境中既可作為活性氧（ROS）的來源也可作為其匯。因此，HA很可能具有顯著改變GO在水環境中納米毒性的潛力。


胚胎發生是生命的關鍵階段，功能失調的胚胎發生與疾病和不良效應相關，如氧化應激、畸形、器官功能障礙和死亡。一些研究調查了碳基納米材料與胚胎的相互作用。例如，暴露于50 mg/L GO的斑馬魚胚胎表現出顯著的孵化延遲，并且在孵出的幼體中觀察到形態缺陷。類似地，多壁碳納米管誘導斑馬魚胚胎出現顯著的發育延遲以及大腦、脊索、眼睛和卵黃囊異常。在這些研究中，大部分注意力集中在原始碳基納米材料對胚胎發生的影響上。然而，關于在NOM存在下毒性的變化和機制卻鮮有報道。卵膜是包圍硬骨魚成熟卵的無細胞包膜，是抵御納米顆粒的第一道屏障。各種研究提出，納米材料穿透或被卵膜吸附，對胚胎發生產生負面影響。然而，卵膜與石墨烯家族納米材料的相互作用機制尚不清楚，尤其是在NOM存在的情況下。


為了評估自然水生系統中的納米毒性，一種選擇是開發一種多層次的方法來測量納米材料的毒性。本文研究了胚胎發育、納米材料-卵膜界面相互作用、納米材料的吸收和轉運、抗氧化酶活性、線粒體損傷、細胞超微結構的改變、蛋白質二級結構的改變以及納米材料與HA的相互作用。這項工作提出了在HA存在下硬骨魚胚胎可行的解毒途徑。


材料與方法


材料

GO（純度99%）購自中國南京先豐納米材料科技有限公司，采用經典的Hummers方法合成。HA（生物級，從褐煤中提取）購自中國上海匯成生物科技有限公司。5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）、5,5',6,6'-四氯-1,1',3,3'-四乙基咪唑羰花青碘化物（JC-1）和2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購自Sigma-Aldrich。其他化學試劑為光譜級或分析級。


GO與HA的相互作用

鑒于HA易于在堿性環境中溶解，將HA懸浮液（500 mg/L）先用1 M NaOH調節至pH 11.0，然后在1200 rpm下磁力攪拌2小時，之后溶液通過0.45μm聚四氟乙烯膜過濾。然后制備進一步的HA溶液（100 mL,10 mg/L，用1 M HCl調節至pH=7.4），并與0.01 g GO輕柔混合24小時（光照/黑暗=14小時/10小時）。隨后，將懸浮液離心（3500g，30分鐘）并過濾（0.2μm聚四氟乙烯膜），在用水輕柔洗滌后收集雜交的GO-HA。使用多種技術表征HA、GO和GO-HA。原子力顯微鏡（AFM）圖像使用Agilent 5420 AFM儀器（Agilent,CA）以輕敲模式獲得。掃描電子顯微鏡（SEM）使用Hitachi SU8010顯微鏡（日本）進行。透射電子顯微鏡（TEM）圖像使用Hitachi HT7700高分辨率透射電子顯微鏡（日本）記錄。使用514 nm激光（Thermo Scientific,DXR）的拉曼光譜（RS）分析GO和GO-HA的結構。傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）譜圖在Bruker Tensor 27紅外光譜儀上記錄，分辨率2 cm-1，步長從4000到400 cm-1。Zeta電位和流體動力學直徑通過動態光散射使用30 mW,657 nm激光（ZetaPALS,Brookhaven,USA）獲得。X射線光電子能譜（XPS）測量使用Axis Ultra XPS系統（Kratos）進行，配備單色Al KαX射線源（1486.6 eV）。使用CasaXPS v2.3.13軟件分析譜圖。