pmoA和16S rRNA基因序列分析。從環(huán)境樣品和菌株SolV的基因組DNA中分離DNA，不使用裂解酶。對于非限制性條件下的pmoA PCR，退火溫度從56°C降至48°C。產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠中純化，并使用TOPO TA克隆試劑盒克隆。用FlexiPrep試劑盒純化質(zhì)粒，并用M13R和M13F引物測序，這些引物側(cè)接載體的克隆位點。對基因組DNA進行焦磷酸測序。

實時RT-PCR分析。從甲烷生長的恒化器培養(yǎng)物中快速冷卻樣品（50 ml，OD600=0.85），并使用Omega RNA提取試劑盒根據(jù)制造商方案分離RNA。使用SolV特異性引物檢測pmoA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。使用引物REVp1032和RevertAid M-MuLV進行逆轉(zhuǎn)錄。使用iQ定制SYBR Green supermix試劑盒根據(jù)制造商說明進行定量PCR。Biorad MyiQ上的PCR程序為95°C 3分鐘，然后40個循環(huán)：95°C 30秒、54°C 30秒、72°C 30秒。

FISH顯微鏡檢查。基于獲得的16S rRNA基因，使用ARB程序的探針設(shè)計軟件設(shè)計了一個新的寡核苷酸探針（SolV830）。該探針的甲酰胺濃度為20%。

動力學(xué)和酶活性。通過測量一系列培養(yǎng)物樣品中的消耗速率來估計對甲烷的親和力。從分批培養(yǎng)物中取10 ml樣品，置于100 ml瓶中，添加不同量的甲烷，并在50°C下以500 r.p.m.劇烈搖動。在一小時內(nèi)測量幾乎線性的速率。速率與所用范圍內(nèi)的細胞密度成正比，表明甲烷沒有傳質(zhì)限制。將5 ml培養(yǎng)物在50°C下在密閉的100 ml瓶中用30 ml甲烷預(yù)培養(yǎng)，以確保甲烷過量于氧氣。從氧氣濃度隨時間下降計算耗氧速率。

菌株SolV的生理特性與生態(tài)意義

菌株SolV在pH 0.8至5.8的范圍內(nèi)均能生長，最適溫度為55°C，在40°C以下和65°C以上僅觀察到微弱生長。其甲烷氧化的最大比生長速率為0.07 h?1（倍增時間10小時）。二氧化碳和泥漿水的無機成分可促進其生長。甲烷氧化遵循典型化學(xué)計量式：CH?+1.6 O?→0.65 CO?+1.55 H?O+0.35 CH?O（生物量），產(chǎn)率為每摩爾甲烷生成6.4克干重。

該菌對低pH環(huán)境下的小分子有機酸（如甲酸鹽、乙酸鹽）極為敏感，這些物質(zhì)在pH 2時完全抑制其生長，但在pH 5時抑制作用消失。此外，菌株SolV還能氧化氫氣，并可在甲醇上生長，但甲醇會暫時抑制甲烷消耗。乙烷作為競爭性底物與甲烷同步轉(zhuǎn)化，而乙炔（0.1%體積比）可立即完全抑制甲烷氧化，證實其依賴pMMO系統(tǒng)。

系統(tǒng)發(fā)育與生態(tài)分布

通過熒光原位雜交（FISH）和16S rRNA基因測序，確認菌株SolV屬于疣微菌門的一個新分支，與已知疣微菌的16S rRNA基因同源性低于81%。其在系統(tǒng)發(fā)育樹上位于包含已知甲烷氧化菌的α-和γ-變形菌門之外，因此被命名為“Acidimethylosilex fumarolicum”（新屬新種）。

BLAST比對顯示，菌株SolV的16S rRNA基因與黃石國家公園酸性熱泉（如Rainbow和Joseph's Coat）的6個環(huán)境克隆序列高度同源（98-99%），表明此類極端嗜酸甲烷氧化菌可能在酸性高溫環(huán)境中廣泛分布。

方法與技術(shù)摘要

研究通過從Solfatara火山泥漿池的富集培養(yǎng)（50°C、pH 2.0）中分離純化得到菌株SolV，采用漂浮濾膜技術(shù)和FISH驗證純度。pmoA及16S rRNA基因通過非限制性PCR擴增和焦磷酸測序分析，揭示其獨特的遺傳特征。酶活性測定顯示菌株具備pMMO、甲醇脫氫酶和甲醛脫氫酶活性，但缺乏sMMO及核酮糖單磷酸途徑關(guān)鍵基因。

結(jié)果

對Solfatara內(nèi)部（以中央泥池（fangaia）為中心，周圍是裸露的酸性土壤（pH 1-2））進行采樣并提取DNA，啟動pmoA基因的分子調(diào)查。本文報道了在環(huán)境克隆文庫中存在pmoA基因，該文庫使用此DNA作為廣泛應(yīng)用的pmoA引物組A189/A682的PCR模板構(gòu)建，該引物組也可能擴增銨單加氧酶β亞基（amoA）的基因。能夠在非限制性條件下（退火溫度從56°C降至48°C；未獲得假陽性克隆）擴增pmoA基因，表明存在與已知序列相似性低的pmoA基因。pmoA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析支持這一點，顯示Solfatara pmoA序列分為兩個簇：一個代表pmoA/amoA系統(tǒng)發(fā)育樹中一個全新的深分支，與已知序列同源性極低（圖1）；另一個簇與Gammaproteobacterial甲烷氧化菌分組。

圖1|推導(dǎo)的PmoA和AmoA蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。顯示了用PAM Dayhoff矩陣計算的鄰接樹，分支上顯示500次重復(fù)的bootstrap值。條形代表50%的估計序列分歧。應(yīng)用不同的建樹方法顯示一致的樹拓撲。

對這些新的pmoA序列感興趣，我們使用該地點的泥漿和混合土壤樣品在50°C和pH 2條件下以甲烷為唯一能源和碳源啟動富集培養(yǎng)。3周后，在土壤和泥漿培養(yǎng)中觀察到甲烷消耗。使用富集培養(yǎng)物的DNA作為模板進行非限制性pmoA序列PCR擴增，產(chǎn)生五個克?。▉碜詢蓚€不同的富集培養(yǎng)物），其序列與環(huán)境克隆中的遠緣組幾乎相同（圖1）。對泥漿培養(yǎng)物進行重復(fù)系列轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基，并最終將培養(yǎng)物稀釋到漂浮的聚碳酸酯濾膜上，獲得純培養(yǎng)物，命名為菌株SolV。1周后濾膜上出現(xiàn)微小的白色菌落，顯微鏡觀察僅顯示一種桿狀形態(tài)型。當(dāng)測試指數(shù)生長期的SolV細胞時，sMMO活性測試（萘轉(zhuǎn)化為萘酚）為陰性，但pMMO活性（顆粒MMO；使用丙烯）可輕松測量（每分鐘每毫克蛋白質(zhì)50 nmol）。從SolV提取基因組DNA并進行焦磷酸測序。從這些數(shù)據(jù)中，我們能夠識別許多C1代謝基因（表1），表明菌株SolV可能使用絲氨酸、四氫葉酸和核酮糖-1,5-二磷酸途徑的新組合進行碳同化。核酮糖單磷酸途徑的診斷基因似乎缺失（表1）。