甲醛的轉(zhuǎn)化似乎由四氫葉酸依賴途徑或直接由甲醛脫氫酶介導(dǎo)（活性每分鐘每毫克蛋白質(zhì)110 nmol）。甲醇脫氫酶活性為每分鐘每毫克蛋白質(zhì)60 nmol，mxaF基因與Methylococcus capsulatus的mxaF有50%同一性。未發(fā)現(xiàn)sMMO的任何亞基。然而，鑒定出兩個(gè)完整的pmoCAB操縱子和一個(gè)具有部分pmoC的pmoCAB簇。發(fā)現(xiàn)與pmoA引物A189/A682有幾個(gè)（二至九個(gè)）錯(cuò)配，解釋了從環(huán)境DNA中PCR擴(kuò)增回收率低的原因。然而，PmoA的所有特征氨基酸都存在，而AmoA的特征氨基酸缺失。在所有細(xì)菌PmoA/AmoA蛋白中所有42個(gè)高度保守的氨基酸中，6至8個(gè)不被SolV菌株的一個(gè)或多個(gè)pmoA基因共享pmoA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示pmoA1和pmoA2與來(lái)自Solfatara和富集培養(yǎng)物的環(huán)境序列高度相似（圖1）。

pmoA3基因代表另一個(gè)全新的深分支。這三個(gè)新的pmoA序列一起表明，甲烷氧化細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育上比目前假設(shè)的更為多樣化。最近的基因組數(shù)據(jù)顯示，一個(gè)Alpha或Gamma變形菌門甲烷氧化菌中可以存在兩個(gè)相同或遠(yuǎn)緣相關(guān)的pmoA基因。使用特異性引物對(duì)甲烷生長(zhǎng)的SolV細(xì)胞提取的mRNA進(jìn)行RT-PCR證實(shí)了pmoA1和pmoA2信使RNA的表達(dá)。通過(guò)透射電子顯微鏡在SolV中未觀察到表達(dá)pMMO的甲烷氧化菌特征性的堆疊膜結(jié)構(gòu)。相反，在用戊二醛固定或冷凍固定后觀察到約50-70 nm的圓形體。這些體可能讓人聯(lián)想到在嗜酸甲烷氧化菌Methylocella palustris中觀察到的囊泡。

圖2|SolV菌株的生長(zhǎng)特性。a，典型生長(zhǎng)曲線顯示在pH 2和55°C條件下甲烷（圓形標(biāo)記）的減少和光密度（三角形標(biāo)記）的增加。該方程是通過(guò)數(shù)據(jù)點(diǎn)的最佳指數(shù)擬合。b，生長(zhǎng)速率與pH值的關(guān)系。插圖展示了pH值低于2時(shí)的數(shù)據(jù)放大圖。不同符號(hào)表示在不同日期進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。

菌株SolV在pH 0.8至5.8之間生長(zhǎng)（圖2）。最適溫度為55°C，在40°C以下和65°C以上僅觀察到輕微生長(zhǎng)。甲烷上的最大比生長(zhǎng)速率為0.07 h-1（倍增時(shí)間10小時(shí)）。二氧化碳和泥漿水的無(wú)機(jī)部分刺激生長(zhǎng)。甲烷根據(jù)甲烷氧化菌的典型化學(xué)計(jì)量轉(zhuǎn)化為二氧化碳：CH4+1.6 O2→0.65 CO2+1.55 H2O+0.35 CH2O（生物量），每摩爾甲烷產(chǎn)率為6.4克干重。乙酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽、甲酸鹽、甲醛和酵母提取物（均為1 gl-1）在pH 2下完全抑制SolV在甲烷上的生長(zhǎng)。該細(xì)菌顯然在低pH值下對(duì)由小有機(jī)酸引起的解偶聯(lián)非常敏感，因?yàn)樵趐H 5時(shí)甲酸鹽（pKa 3.75）不抑制生長(zhǎng)。在100 mM NaCl以上或含葡萄糖的培養(yǎng)基中不發(fā)生生長(zhǎng)。除甲烷外，氫氣也被氧化。菌株SolV在甲醇上生長(zhǎng)良好，但添加的甲醇完全抑制甲烷消耗。甲醇耗盡后，甲烷消耗和生長(zhǎng)僅在4小時(shí)后開始。乙烷抑制生長(zhǎng)，盡管它作為競(jìng)爭(zhēng)底物與甲烷同時(shí)以幾乎相同的速率轉(zhuǎn)化。乙炔（0.1%v/v）立即引起甲烷消耗的完全抑制，這一觀察結(jié)果支持pMMO是主要的甲烷氧化系統(tǒng)。SolV可以使用銨和硝酸鹽作為氮源。沒(méi)有甲烷時(shí)在銨上不發(fā)生生長(zhǎng)。未觀察到固氮和厭氧硝酸鹽依賴的甲醇氧化。

SolV對(duì)甲烷的典型Ks值為6μM。然而，對(duì)氧的親和力異常高（Ks 0.7μM），反映了在其自然棲息地中需要競(jìng)爭(zhēng)氧氣，其中微生物耗氧和持續(xù)流動(dòng)的缺氧噴氣孔氣體（主要含二氧化碳）將導(dǎo)致氧氣濃度非常低。

使用主要覆蓋疣微菌目的探針EUBIII對(duì)分離物進(jìn)行熒光原位雜交（FISH）分析，顯示強(qiáng)烈的雜交信號(hào)。使用EUBI、EUBII或alpha（ALF968）、beta（BET42a）或gamma（GAM42a）變形菌門探針未獲得信號(hào)。疣微菌門樣身份通過(guò)從焦磷酸測(cè)序獲得的其16S rRNA基因序列確認(rèn)。基于該序列設(shè)計(jì)了一個(gè)特異性探針（SolV830，見(jiàn)方法），并與探針EUBIII一起使用以確認(rèn)SolV培養(yǎng)物的純度。來(lái)自指數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物的所有細(xì)胞顯示雙重雜交。SolV的16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該分離物代表疣微菌門內(nèi)一個(gè)新細(xì)分中的第一個(gè)成員（圖3）。成對(duì)距離分析顯示與其他細(xì)分的成員同一性低于81%。

圖3|SolV菌株的16S rRNA基因序列與浮霉菌門（Planctomycetes）代表物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

菌株SolV是首次報(bào)道的極端嗜酸甲烷氧化細(xì)菌，在系統(tǒng)發(fā)育上位于包含已知甲烷氧化菌的Alpha和Gammaproteobacteria亞門之外，我們建議將其命名為：“Acidimethylosilex fumarolicum”，新屬新種。

迄今為止，疣微菌門僅包含少數(shù)培養(yǎng)菌株，它們是厭氧或好氧異養(yǎng)菌，在或多或少?gòu)?fù)雜的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)于糖類上。然而，環(huán)境克隆文庫(kù)顯示疣微菌門存在巨大的生物多樣性，并且在許多生態(tài)系統(tǒng)（土壤、泥炭沼澤、酸性巖石排水和垃圾滲濾液）中經(jīng)常以相對(duì)較高的數(shù)量出現(xiàn)，但生理學(xué)未知。有趣的是，推測(cè)廣泛分布的疣微菌門（其大多數(shù)成員尚未培養(yǎng)）可能與地球化學(xué)相關(guān)反應(yīng)有關(guān)。使用菌株SolV 16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST搜索顯示與六個(gè)環(huán)境克隆具有非常高的同一性（98-99%）（圖3），這些克隆是在黃石國(guó)家公園酸性熱泉（Rainbow和Joseph's Coat）微生物群落地球化學(xué)研究期間獲得的（未發(fā)表；NCBI登錄號(hào)：AY882698、AY882699、AY882710、AY882819、AY882820和AY882834）。這表明與A.fumarolicum相似的細(xì)菌可能是這些極端環(huán)境的常見(jiàn)居民。新的pmoA和16S rRNA基因序列可能有助于從較少極端的棲息地識(shí)別Planctomycetes/Verrucomicrobia/Chlamydiae超門甲烷氧化菌，并顯示它們的全球分布。

結(jié)論

該研究首次發(fā)現(xiàn)疣微菌門中存在極端嗜酸甲烷氧化功能，擴(kuò)展了對(duì)甲烷氧化微生物多樣性的認(rèn)知。菌株SolV對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制（如高氧親和力、多pmoA基因）為其在酸性自然生境中的生態(tài)角色提供了依據(jù)，同時(shí)提示疣微菌門可能在全球碳循環(huán)中扮演尚未被重視的關(guān)鍵作用。