摘要-本文報(bào)告了我們在輔助技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，是在哺乳動(dòng)物胚胎的植入前培養(yǎng)及其通過代謝活性評估進(jìn)行原位表征方面，開發(fā)的一種集成傳感平臺(tái)。整個(gè)平臺(tái)包括一個(gè)納升級培養(yǎng)室，該培養(yǎng)室集成了一個(gè)氧氣傳感器，用于監(jiān)測個(gè)體胚胎的呼吸活性，作為其存活力和發(fā)育能力的標(biāo)志物。我們首先討論了微流體技術(shù)在實(shí)現(xiàn)此類集成傳感平臺(tái)方面的關(guān)鍵優(yōu)勢。接著，我們介紹了該培養(yǎng)裝置及其在小鼠胚胎上的驗(yàn)證結(jié)果。第一階段的驗(yàn)證表明，微流體技術(shù)能夠支持小鼠胚胎直至單個(gè)胚胎水平的全程發(fā)育，其出生率與傳統(tǒng)格式的群體培養(yǎng)相當(dāng)。在第二步中，該裝置被升級用于人類胚胎的培養(yǎng)，并在捐贈(zèng)的凍融胚胎上進(jìn)行了測試。最后，我們描述了一種由超微電極陣列組成的氧氣傳感器，該傳感器將被集成到培養(yǎng)裝置中。利用這種基于超微電極的傳感器，我們還提出了一種在短時(shí)間尺度上進(jìn)行測量的新方法，該方法可以顯著減少電化學(xué)測量過程中消耗的氧氣量。目前的工作重點(diǎn)是將該傳感器集成到培養(yǎng)平臺(tái)中，并在生物材料上進(jìn)行驗(yàn)證。該集成平臺(tái)目前正在使用作為哺乳動(dòng)物胚胎替代物的球體上進(jìn)行測試，之后將應(yīng)用于小鼠胚胎。

I.引言

微流體技術(shù)可以定義為一種利用具有微米尺度結(jié)構(gòu)來精確操縱低納升范圍小體積的技術(shù)。微流體技術(shù)，也稱為芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成熟，并因其提供的諸多優(yōu)勢而在生命科學(xué)領(lǐng)域變得非常流行。具體來說，微流體設(shè)備能夠使用更少量的試劑，實(shí)現(xiàn)更快、更靈敏和可重復(fù)的分析。此外，微流體技術(shù)非常適合實(shí)現(xiàn)復(fù)雜、高度并行化和集成的平臺(tái)。

最初，微流體的發(fā)展是由生物分析領(lǐng)域推動(dòng)的。然而，芯片實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用近年來已經(jīng)多樣化并擴(kuò)展到細(xì)胞研究領(lǐng)域，對此，微流體技術(shù)呈現(xiàn)出額外的優(yōu)勢：對細(xì)胞微環(huán)境具有精妙的時(shí)空控制能力；由于高度的限制性和流動(dòng)的層流特性，能夠創(chuàng)建類體內(nèi)條件；動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件；以及獨(dú)特的集成智能功能的能力，例如傳感器，用于原位、實(shí)時(shí)、非侵入性地監(jiān)測細(xì)胞微環(huán)境和/或細(xì)胞行為。微流體技術(shù)目前被用于廣泛的應(yīng)用，從單細(xì)胞分析和實(shí)驗(yàn)到三維細(xì)胞培養(yǎng)和研究，以及開發(fā)與生理相關(guān)的體外模型，即器官芯片平臺(tái)。

在此，我們聚焦于一個(gè)特定的應(yīng)用領(lǐng)域，該領(lǐng)域可以因使用微流體技術(shù)而大大受益，基于上述所有原因，這個(gè)領(lǐng)域就是輔助生殖技術(shù)。輔助生殖技術(shù)，包括所有使用人工手段實(shí)現(xiàn)妊娠的方法，在全球范圍內(nèi)的使用日益增多，已有超過500萬嬰兒通過這些技術(shù)誕生。對于輔助生殖技術(shù)而言，微流體技術(shù)可以特別為整個(gè)治療過程中的各種體外步驟提供替代方法，從而彌補(bǔ)當(dāng)前遇到的問題。

在本文中，我們特別關(guān)注體外輔助生殖技術(shù)方案中的兩個(gè)獨(dú)立步驟，即胚胎的植入前培養(yǎng)及其表征，目的是監(jiān)測其生長并識(shí)別具有最高發(fā)育潛能以供移植的胚胎。具體來說，我們首先報(bào)告了一個(gè)為哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)開發(fā)的微流體平臺(tái)，及其在單個(gè)小鼠胚胎培養(yǎng)中的成功應(yīng)用。接著，我們介紹了該微流體平臺(tái)用于捐贈(zèng)的凍融人類胚胎培養(yǎng)的早期驗(yàn)證結(jié)果。對于胚胎的原位表征，我們介紹了一種電化學(xué)氧氣傳感器和一種旨在最小化測量過程中氧氣消耗量的新型傳感原理。最后，我們介紹了將該傳感器集成到培養(yǎng)微流體平臺(tái)中的情況，及其在腫瘤球體（此處用作哺乳動(dòng)物胚胎的替代物）上的早期驗(yàn)證結(jié)果。

II.用于小鼠胚胎植入前培養(yǎng)的微流體裝置

作為第一步，開發(fā)了一個(gè)用于哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)的平臺(tái)，以評估微流體技術(shù)是否能夠支持單個(gè)胚胎的植入前生長，直至單個(gè)胚胎水平，并最終實(shí)現(xiàn)全程發(fā)育。該培養(yǎng)裝置包括一個(gè)納升級培養(yǎng)室，胚胎被捕獲其中，并可輕松取出，用于移植或進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)（圖1）。該微流體裝置采用聚二甲基硅氧烷通過軟光刻技術(shù)制造，并鍵合在玻璃基板上。

圖1.用于單個(gè)小鼠胚胎培養(yǎng)的微流體平臺(tái)的設(shè)計(jì)圖和照片。該平臺(tái)包含一個(gè)納升級體積的培養(yǎng)室，其入口和出口處設(shè)有結(jié)構(gòu)以防止胚胎在培養(yǎng)過程中逃逸。值得注意的是，入口處的結(jié)構(gòu)仍允許取出胚胎用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)或移植。

與任何為輔助生殖技術(shù)開發(fā)的新技術(shù)一樣，該培養(yǎng)裝置首先在動(dòng)物模型（此處為小鼠）上進(jìn)行測試。從小鼠體內(nèi)收集自然受精的胚胎，將這些受精卵分成20個(gè)或5個(gè)胚胎一組，或作為單個(gè)胚胎分離。隨后，將這些胚胎在具有30或270納升培養(yǎng)室的微流體裝置中，或作為對照，在覆蓋礦物油以防止蒸發(fā)問題的5微升培養(yǎng)基液滴中進(jìn)行培養(yǎng)。考慮兩個(gè)終點(diǎn)來評估胚胎的發(fā)育潛能：一方面是體外培養(yǎng)4-5天后的植入前生長情況，以囊胚率（囊胚是胚胎在發(fā)育此時(shí)應(yīng)達(dá)到的階段）進(jìn)行檢驗(yàn)；另一方面是它們的全程生長或出生率。對于第二個(gè)終點(diǎn)，部分胚胎在體外培養(yǎng)3.5天后從培養(yǎng)平臺(tái)中取出，并移植到假孕小鼠體內(nèi)，使其完成發(fā)育。