此處測試的所有微流體培養(yǎng)條件（1、5和20個(gè)胚胎，以及30和270納升的培養(yǎng)室體積）產(chǎn)生的囊胚率均高于90%，而相同胚胎組大小的傳統(tǒng)液滴培養(yǎng)產(chǎn)生的發(fā)育率顯著較低（30-75%），具體數(shù)值取決于胚胎組大小（圖2）。關(guān)于單胚胎培養(yǎng)，微流體方法被證明非常有前景，囊胚率約為95%，而液滴格式僅為較低的30%（圖2）。

接下來，考慮胚胎的全程發(fā)育，以確保所使用的體外培養(yǎng)條件不會損害胚胎。兩種培養(yǎng)平臺（微流體裝置和傳統(tǒng)液滴）的總體出生率相似，均約為30%（圖3）。然而，在檢查單胚胎培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)微流體設(shè)置中的性能顯著更優(yōu)（>30%對比液滴格式的20%），并且培養(yǎng)體積越小，出生率越高（圖3）。這些結(jié)果共同表明，使用限制性培養(yǎng)條件有利于胚胎生長，直至單個(gè)胚胎水平，這不僅體現(xiàn)在植入前階段，也體現(xiàn)在全程發(fā)育方面。這種由限制性帶來的優(yōu)勢可以，例如，通過胚胎分泌促進(jìn)其發(fā)育的生長因子這一事實(shí)來解釋，并且它們可以在納升腔內(nèi)創(chuàng)建一個(gè)這些生長因子高濃度的微環(huán)境。相反，在較大體積中，這些生長因子被高度稀釋，因此導(dǎo)致胚胎發(fā)育受損或延遲，正如在液滴培養(yǎng)中觀察到的那樣。

III.用于人類胚胎體外培養(yǎng)的微流體系統(tǒng)

這種單胚胎培養(yǎng)方法和微流體平臺隨后在人類胚胎上進(jìn)行了測試。微流體平臺的設(shè)計(jì)進(jìn)行了升級，包括一個(gè)更大的培養(yǎng)室（約640納升）以容納人類胚胎（其大小大約是小鼠胚胎的兩倍），該裝置仍然使用相同的制造工藝由聚二甲基硅氧烷和玻璃生產(chǎn)。在此第二階段的驗(yàn)證中使用了捐贈的人類胚胎（CCMO授權(quán)號NL38300.000.11），這些胚胎此前保存在液氮中。這些胚胎在發(fā)育第4天時(shí)被取出，首先解凍，然后在微流體裝置中以及作為對照，在覆蓋礦物油的25微升培養(yǎng)基液滴中培養(yǎng)長達(dá)72小時(shí)。總共有120個(gè)胚胎被納入研究，并隨機(jī)分配到微流體系統(tǒng)和傳統(tǒng)液滴中。在24、28、48和72小時(shí)的不同時(shí)間點(diǎn)對胚胎進(jìn)行分級，評估其囊胚率和階段，以判斷其發(fā)育進(jìn)程。

第二階段的驗(yàn)證證實(shí)了聚二甲基硅氧烷微流體系統(tǒng)支持單個(gè)胚胎生長的能力。然而，兩種培養(yǎng)平臺發(fā)現(xiàn)了相似的生長率，并未看到微流體系統(tǒng)的明顯優(yōu)勢（圖4）。與小鼠研究結(jié)果的這種差異可以解釋為，在第4天，人類胚胎已經(jīng)經(jīng)歷了其發(fā)育過程中的關(guān)鍵步驟；例如，基因組激活在8細(xì)胞階段（發(fā)育第3天）之前就已經(jīng)發(fā)生。

IV.用于原位監(jiān)測胚胎生長和發(fā)育能力的氧氣傳感器

作為開發(fā)用于單胚胎培養(yǎng)和表征的集成平臺的下一步，開發(fā)了一種氧氣傳感器。氧氣，作為胚胎代謝的整體標(biāo)志物，已被公認(rèn)為胚胎活力和發(fā)育能力的指標(biāo)。我們開發(fā)了一種電化學(xué)傳感器，由一個(gè)作為工作電極的超微電極陣列組成。該傳感器的第一個(gè)原型包括16、25或36個(gè)超微電極的方形陣列，每個(gè)電極直徑為2微米，電極間距為20微米（圖5）。所有電極（超微電極陣列、對電極和參比電極）均在玻璃上由鉑制成，超微電極圖案化在氧化物-氮化物-氧化物絕緣層中。

首先，確定了溶解氧的還原電位，在磷酸鹽緩沖液中發(fā)現(xiàn)還原電位為-0.2伏。為了最小化電化學(xué)測量過程中的氧氣消耗，開發(fā)了一種創(chuàng)新的傳感方案。具體來說，施加一個(gè)短于5毫秒的-0.2伏脈沖，并連續(xù)測量還原電流。在這個(gè)短時(shí)間尺度上，超微電極周圍的擴(kuò)散輪廓保持在線性狀態(tài)，因此傳感器行為遵循Cottrell方程。隨后，溶解氧濃度可以從以下公式推導(dǎo)出：

使用這種新型傳感原理，通過氮?dú)夤呐莞淖內(nèi)芙庋鯘舛龋瑫r(shí)使用來自Unisense的商業(yè)傳感器監(jiān)測傳感器響應(yīng)以及實(shí)際的溶解氧濃度，對所提出的基于超微電極的傳感器進(jìn)行了校準(zhǔn)。對于36超微電極傳感器，發(fā)現(xiàn)溶解氧濃度與傳感器響應(yīng)之間存在極好的線性相關(guān)性，靈敏度為0.49 nA.s^{-0.5}.L.mg^{-1}（圖6）。最后，評估了通過測量消耗的氧氣量；對于一個(gè)5毫秒的脈沖，大約消耗了63飛摩爾的氧氣，這顯著低于使用標(biāo)準(zhǔn)微電極時(shí)的消耗量。

接下來，將超微電極陣列傳感器集成到微流體裝置中，用于結(jié)合胚胎培養(yǎng)和表征。為此，改變了微流體裝置的設(shè)計(jì)，包括一個(gè)捕獲位點(diǎn)，用于在氧氣傳感器附近捕獲單個(gè)胚胎（圖7）。迄今為止，該集成傳感平臺僅在腫瘤球體上進(jìn)行了測試，這些球體被用作胚胎的替代物，用于集成傳感平臺的第一階段驗(yàn)證。將球體引入裝置后，使用集成傳感器和新型短測量時(shí)間方法隨時(shí)間監(jiān)測其耗氧量。通常，在監(jiān)測2小時(shí)后，測量到裝置內(nèi)的溶解氧濃度相比大氣條件下降了約1毫克/升。下一步，該傳感裝置將在小鼠胚胎上進(jìn)行測試。

V.結(jié)論

該項(xiàng)目的最終目標(biāo)是開發(fā)一個(gè)集成平臺，用于基于非侵入性和代謝參數(shù)的單胚胎培養(yǎng)與表征相結(jié)合。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，第一步，我們實(shí)現(xiàn)并成功驗(yàn)證了一個(gè)用于單胚胎培養(yǎng)的微流體平臺。經(jīng)過調(diào)整后，同一平臺在捐贈的人類胚胎上進(jìn)行了測試。同時(shí)，我們開發(fā)了一種由超微電極陣列組成的電化學(xué)傳感器，用于在培養(yǎng)室內(nèi)原位監(jiān)測胚胎的呼吸速率，作為其代謝和活力的整體標(biāo)志物。我們特別提出了一種與該傳感器結(jié)合使用的新型傳感原理，以最小化電化學(xué)測量所消耗的氧氣量。目前的工作重點(diǎn)是將所提出的傳感器集成到培養(yǎng)微流體平臺中，在球體（用作胚胎替代物）上驗(yàn)證整個(gè)平臺，然后才能在安全地在小鼠胚胎上評估該集成傳感平臺。