摘要

背景：細菌納米纖維素（BNC）在人造血管、食道和尿道等應(yīng)用方面具有前景。已有幾種生物反應(yīng)器用于合成BNC管，然而，關(guān)于生物合成過程和管性能的差異知之甚少。本研究首次比較了兩種類型的生物反應(yīng)器，即雙硅膠管（D-BNC）和單硅膠管（S-BNC）生物反應(yīng)器，以評估分別使用50 g L-1和100 g L-1的果糖或葡萄糖制備BNC管的過程和性能差異。

結(jié)果：兩種生物反應(yīng)器顯示出不同的BNC管生產(chǎn)生物合成過程。由于氧氣供應(yīng)更充足，D-BNC生物反應(yīng)器生產(chǎn)的BNC管產(chǎn)量更高，機械性能更好。較高的果糖濃度導致D-BNC產(chǎn)量增加，但糖的類型和濃度對S-BNC產(chǎn)量影響不大。果糖賦予更強的機械性能，但透水性較低。用100 g L-1果糖制備的兩種類型的管均由多孔納米纖維網(wǎng)絡(luò)組成，但顯示出不同的橫截面形態(tài)和纖維分布。

結(jié)論：本研究揭示了兩種生物反應(yīng)器中BNC管的生物合成過程及其與性能的相關(guān)性。研究結(jié)果為指導如何調(diào)控BNC管的結(jié)構(gòu)和性能以用于包括人造血管在內(nèi)的生物醫(yī)學假體提供了依據(jù)。

引言

對于替代小口徑血管（<6mm）的人造血管的需求日益增長，特別是在搭橋手術(shù)中。1膨脹聚四氟乙烯（ePTFE）和聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）人造血管已臨床應(yīng)用于較大血管的置換。然而，諸如內(nèi)膜增生和栓塞等嚴重問題限制了它們在小血管移植中的應(yīng)用。2-4目前搭橋手術(shù)的標準是使用自體血管，如內(nèi)乳動脈或大隱靜脈。除了來源有限和手術(shù)過程中額外的手術(shù)步驟外，5,6采集這些血管可能對原始組織或器官造成損害。因此，非常需要適用于生產(chǎn)小血管的新材料。

細菌納米纖維素（BNC）是一種由某些微生物（例如木醋桿菌）在培養(yǎng)基氣液界面分泌的纖維素，因其優(yōu)異的性能而被研究作為小血管替代物，這些性能包括在寬范圍的溫度和pH值下的穩(wěn)定性、高純度和超強持水性、良好的機械性能和生物相容性、超細納米纖維網(wǎng)絡(luò)和高孔隙率。研究人員發(fā)現(xiàn)，通過使用氫氧化鈉處理然后水洗的純化方法，可以輕松消除BNC中的內(nèi)毒素，以滿足FDA對與血液接觸的植入物的要求（每個醫(yī)療器械<20 EU）。纖維網(wǎng)絡(luò)中高持水量可防止血液中蛋白質(zhì)的吸附，這有利于血液相容性。14在體內(nèi)動物實驗中，柔韌的纖維網(wǎng)絡(luò)和孔隙為細胞粘附和向內(nèi)生長以形成新的血管組織提供了合適的基質(zhì)。

小口徑BNC管已通過在不同類型的生物反應(yīng)器中，使用不同的菌株和培養(yǎng)基進行原位培養(yǎng)制備。15 Hong等人總結(jié)了四種制備BNC管的生物反應(yīng)器。16來自不同生物反應(yīng)器的BNC管表現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)和性能。例如，在氧滲透性硅膠管表面形成的BNC管（該硅膠管浸沒在接種的培養(yǎng)基中，并有空氣入口通過硅膠管）顯示出多層橫截面形態(tài)和機械性能不足。13,17,18據(jù)報道，這種BNC管的形態(tài)和機械性能可以通過改變生物合成過程中的氧氣比例來控制。13與確定成分培養(yǎng)基相比，復合培養(yǎng)基導致更高的BNC產(chǎn)量。13另一種在雙硅膠管生物反應(yīng)器中制備的BNC管顯示出完整的橫截面形態(tài)，沒有多層結(jié)構(gòu)，盡管其BNC的形成機制與第一種生物反應(yīng)器相似。16 BNC管的機械性能受培養(yǎng)時間影響。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)碳源和氮源在BNC的生產(chǎn)中起著重要作用。19,20所有這些結(jié)果表明，BNC管的結(jié)構(gòu)和性能可以通過培養(yǎng)條件進行調(diào)控，包括營養(yǎng)源、氧氣比例、菌株類型、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)生物反應(yīng)器。然而，關(guān)于培養(yǎng)條件對BNC管性能影響的系統(tǒng)研究尚未充分進行。

為了探索制備具有理想結(jié)構(gòu)和性能的BNC管的最佳因素，本研究首次比較了兩種不同類型生物反應(yīng)器中培養(yǎng)過程以及所制備BNC管性能的差異。使用產(chǎn)BNC的木醋桿菌CGMCC No.1186，在不同濃度的葡萄糖和果糖中培養(yǎng)，分別在Bodin等人13和Hong等人16描述的兩種生物反應(yīng)器中獲得BNC管。測定培養(yǎng)過程中殘留糖濃度、pH變化、溶解氧、細菌細胞分布和BNC產(chǎn)量，以探索BNC形成的機制。對BNC管的爆破壓、透水性、拉伸強度和形態(tài)進行了表征。這些結(jié)果為BNC管在血管移植物、人造食道和尿道等管狀植入假體中的制備和應(yīng)用提供了更多有益的知識。

材料與方法

化學品和菌株

除非另有說明，所有使用的化學品均為分析純，購自中國上海國藥集團化學試劑有限公司。一株從海南耶國食品有限公司獲得的木醋桿菌，保藏號為CGMCC No.1186（中國普通微生物菌種保藏管理中心，北京），在含有2.5%D-葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物（Oxoid,UK）和1.8%瓊脂的瓊脂平板上保存，初始pH為5.0。

為了生產(chǎn)BNC管，將糖添加到含有5g L-1蛋白胨和3g L-1酵母提取物（Oxoid,UK）的液體培養(yǎng)基中，使果糖和葡萄糖的最終濃度分別達到50和100g L-1，以制備四種生產(chǎn)培養(yǎng)基，初始pH為5.0。

預(yù)培養(yǎng)物的制備

從瓊脂平板上取兩環(huán)菌種轉(zhuǎn)移到含有上述300 mL生產(chǎn)培養(yǎng)基的1000 mL錐形瓶中。在30°C、160 rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上振蕩培養(yǎng)12-24小時后，獲得用于生產(chǎn)BNC管的預(yù)培養(yǎng)物。