結果與討論

BNC管的生產

選擇兩種類型的生物反應器，分別使用初始濃度為50 g L-1和100 g L-1的果糖和葡萄糖制備BNC管。如圖2所示，在同一類型的生物反應器中，使用不同糖類型和初始濃度制備的培養液的初始DO沒有差異（P>0.05）。然而，D-BNC生物反應器中的初始DO比S-BNC生物反應器高約60%（1100-1143μmol L-1，而S-BNC生物反應器中為684-697μmol L-1），這是因為外部硅膠管界面提供了額外的氧氣補充。在培養過程中，兩種生物反應器中四種類型培養基的DO在最初幾天迅速下降，然后在接下來的培養期保持恒定，表明在4-6天之前的早期階段，細菌的DO消耗速度快于DO供應，然后達到平衡。然而，當在培養基中使用兩種不同的糖時，不同生物反應器中的DO水平變化不同。

如圖2（A）所示，在S-BNC中培養4天后，果糖培養基中的DO遠低于葡萄糖培養基（72-94μmol L-1對比149-211μmol L-1）。較低的DO值意味著更高的代謝。不同的糖濃度在DO變化中沒有引起顯著差異。對于D-BNC培養（圖2（B）），與葡萄糖相比，果糖也實現了更快的代謝。葡萄糖濃度在DO變化中沒有引起大的差異。然而，由于D-BNC生物反應器具有更高的氧氣供應能力，最終的DO值（葡萄糖為765-784μmol L-1，果糖為421-553μmol L-1）遠高于S-BNC培養（葡萄糖為149-211μmol L-1，果糖為72-94μmol L-1）。不同的是，當使用果糖時，100 g L-1的濃度導致比50 g L-1更低的DO，表明細菌的生長和BNC的合成是不同的。

BNC網絡的形成可能會鎖定大量的培養液在纖維網絡中，這可能會增加DO擴散阻力。圖3顯示了使用100 g L-1果糖培養4天后兩種生物反應器中的DO分布。在S-BNC生物反應器中，靠近內部硅膠管（IP）位置的DO為89.5±2.7μmol L-1，約為初始DO的13%?？拷獠抗埽∣P）位置和兩管之間空腔中間位置（MP）的氧濃度分別約為11.0±1.8μmol L-1和16.2±6.9μmol L-1。盡管在培養過程中氧氣通過內部硅膠管流入，但OP和MP處嚴重的缺氧環境可能是由S-BNC纖維網絡中的DO擴散限制和細菌的高耗氧量引起的。在D-BNC生物反應器中，由于外部硅膠管提供了額外的氧氣供應，IP和OP處的溶解氧分別約為191.6±10.4μmol L-1和458.3±20.1μmol L-1。OP處較高的DO意味著由于更大的表面積，從外部硅膠管獲得了更多的氧氣供應。與S-BNC管培養相比，IP處較高的DO也可能歸因于更多的氧氣供應。然而，MP處的DO水平仍然較低（8.13±1.9μmol L-1），原因與S-BNC生物反應器相同。

沿口徑方向的不均勻DO分布可能導致細菌細胞的不同分布。為了研究這一點，制備了培養4天時BNC管的冷凍切片，并應用SYTO 9綠色熒光核酸染料使細胞發出綠色熒光。如圖4所示，在未純化的S-BNC和D-BNC標本的冷凍切片圖像中，分別發現了一個和兩個與強綠色熒光相關的區域。結果表明，在靠近硅膠管支撐物（可視為氣液界面）處存在一個細菌細胞區，因為熒光染料SYTO 9可以特異性結合細胞的DNA和RNA并發出強熒光。這一發現與靜態培養中只有氣液界面的細菌才能保持其活性的事實相符。15與S-BNC管制備中僅在內部硅膠管附近出現一個細菌細胞區不同，在D-BNC管制備中發現了兩個細菌細胞區。該結果有力地驗證了Hong等人16報道的在兩個硅膠管表面形成兩個BNC層的結果。靠近硅膠管表面的區域中細菌細胞的聚集分布應導致在硅膠管周圍產生更多的BNC，這可能會限制氧氣向遠離硅膠管表面的更遠距離擴散。并且聚集的細菌細胞可能快速消耗DO。所有這些結果使得氧氣分布更加不均勻。因此，來自兩種類型生物反應器的BNC管中的纖維分布可能不同。

選擇培養4天的樣品進行細菌細胞分布表征基于以下方面。在4天之前，S-BNC管尚未形成。因此，不可能制備切片標本來分析細胞分布。在培養4天后，研究中未檢測到不同培養時間細胞分布輪廓的顯著差異。最重要的是，根據微生物學中的典型生長曲線，細菌細胞在培養4天時最為活躍，這在DO和殘留糖的變化曲線（圖2和圖5）中顯示在大約4天的時間點有一個拐點。

分別研究了50 g L-1和100 g L-1的葡萄糖和果糖作為碳源，用于兩種生物反應器中的BNC管生產。圖5說明了木醋桿菌在兩種生物反應器中培養期間糖消耗的變化。結果表明，在相同初始濃度下，葡萄糖的消耗速度快于果糖。在初始濃度為50 g L-1葡萄糖的條件下，培養14天后，S-BNC和D-BNC生物反應器中的殘留濃度分別降至10.8 g L-1和7.9 g L-1。在初始濃度為50 g L-1時，殘留果糖濃度僅分別降至約38.7 g L-1和23.1 g L-1（圖5（A））。D-BNC培養比S-BNC消耗更多的糖。如上所述，D-BNC生物反應器的氧氣供應更好，這可能有利于細菌的生長。因此，消耗了更多的糖。

圖6（A）顯示了使用50 g L-1糖進行BNC管培養期間pH值的變化。當使用50 g L-1葡萄糖時，兩種BNC管培養過程中的pH值在3天后迅速降至約2.5，并保持恒定至14天。然而，使用50 g L-1果糖的D-BNC培養中的pH在4天后降至約4.2，然后變得恒定。相同條件下S-BNC培養中的pH在6天后降至約4.4。pH變化的趨勢與糖消耗相對應。先前的研究表明，酸是BNC培養中的副產物，導致pH降低。21當使用葡萄糖作為碳源時會產生更多的酸，隨后較低pH嚴重限制了BNC的分泌。21使用50 g L-1果糖培養14天后，S-BNC和D-BNC管的最終產量分別為0.75±0.10 g L-1和3.05±0.28 g L-1，而使用50 g L-1葡萄糖作為碳源的BNC產量分別為0.46±0.04 g L-1和1.01±0.09 g L-1（圖7）。

結果表明，果糖更適用于兩種生物反應器中的BNC生產。果糖BNC合成過程中較低的pH變化對BNC生產的負面影響較小，因此D-BNC管的產量高于使用葡萄糖和果糖生產的S-BNC，這與更多的糖消耗一致。這是因為BNC基質可以在D-BNC生物反應器中從兩個方向形成，而在S-BNC生物反應器中，BNC僅作為模板在單個硅膠管表面形成。13此外，D-BNC生物反應器中更好的氧氣供應可能有助于提高產量。