水通道蛋白是負責跨膜轉(zhuǎn)運水和其他小型中性分子的膜整合蛋白。盡管它們在水轉(zhuǎn)運中的重要性已得到公認，但它們在氣體轉(zhuǎn)運過程中的意義仍不清楚。越來越多的證據(jù)表明植物水通道蛋白參與光合作用的二氧化碳輸送。這些通道蛋白在氧氣和其他氣體轉(zhuǎn)運中的作用可能也比先前設(shè)想的更為重要。在本研究中，我們通過在酵母中共同表達異源水通道蛋白和肌紅蛋白，檢測了各種人類、植物和真菌水通道蛋白的氧氣通透性。通過使用酵母原生質(zhì)體的分光光度測定法，證實了兩種最有前景的氧氣轉(zhuǎn)運體（智人AQP1和煙草PIP1;3）能促進氧氣轉(zhuǎn)運。在酵母懸浮培養(yǎng)物中，過表達NtPIP1;3顯著提高了其氧氣吸收速率。在遭受低氧水培條件的煙草根中，經(jīng)過七天的低氧處理后，轉(zhuǎn)運氧氣的水通道蛋白NtPIP1;3的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，同時根尖段的ATP水平也增加。我們的研究結(jié)果表明，應(yīng)進一步探索水通道蛋白介導的氧氣轉(zhuǎn)運的功能意義以及控制跨膜氧氣轉(zhuǎn)運速率的可能性。

自從發(fā)現(xiàn)膜內(nèi)在蛋白參與跨膜水轉(zhuǎn)運以來，越來越多的證據(jù)將水通道蛋白家族的不同成員與其他小型中性分子（包括二氧化碳）的轉(zhuǎn)運過程聯(lián)系起來。這些分子的轉(zhuǎn)運與基本的生理過程相關(guān)。與長期流行的關(guān)于水轉(zhuǎn)運的觀點類似，孔介導的二氧化碳和氧氣轉(zhuǎn)運可能具有的重要意義有時被低估，因為理論和實驗證據(jù)表明這些氣體能快速通過脂質(zhì)雙分子層擴散。雖然水通道蛋白介導的二氧化碳轉(zhuǎn)運的功能意義已在光合作用和細胞信號傳導過程中得到證實，但孔介導的氧氣轉(zhuǎn)運對跨細胞氧氣通量和細胞功能的重要性仍然難以捉摸。

在本研究中，我們使用酵母細胞系統(tǒng)，在酵母表達載體pAG426GAL-ccdB中共同表達抹香鯨肌紅蛋白（在酵母表達載體pAG425GAL-ccdB中）與20種來自人類、植物或真菌的不同水通道蛋白之一，以評估異源水通道蛋白表達對肌紅蛋白氧合的影響，將其作為酵母質(zhì)膜氧氣通透性的指標。我們還檢測了水培低氧條件下煙草根中質(zhì)膜內(nèi)在蛋白的轉(zhuǎn)錄豐度與ATP水平的關(guān)系，以評估轉(zhuǎn)運氧氣的水通道蛋白可能的功能意義。

方法

肌紅蛋白和水通道蛋白在酵母中的表達。抹香鯨肌紅蛋白的完整開放閱讀框從pMB41亞克隆到酵母表達載體pAG425GAL-ccdB中，通過Gateway技術(shù)。20個感興趣的水通道蛋白基因的完整開放閱讀框分別從pGEM-T Easy亞克隆到酵母表達載體pAG426GAL-ccdB中，采用相同方法。這些基因包括來自智人的三種動物水通道蛋白，來自煙草的12種植物水通道蛋白，以及來自擬南芥的植物水通道蛋白。

擬南芥（Arabidopsis thaliana），以及來自雙色蠟?zāi)ⅲ↙accaria bicolor）的五個真菌水通道蛋白——LbAQP1（JQ585592）、LbAQP3（JQ585593）、LbAQP5（JQ585594）、LbAQP6（JQ585595）和LbAQP7（JQ585596）。通過引物GAL1（AATATACCTCTATACTTTAACGTC）在桑格測序中驗證了構(gòu)建體。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株INVSc1（MATa his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52；Invitrogen）按照小規(guī)模酵母轉(zhuǎn)化方案（Invitrogen），用pAG425GAL-ccdB+肌紅蛋白載體和其中一個PAG426GAL-ccdB+水通道蛋白載體進行了雙重轉(zhuǎn)化。作為模擬對照，INVSc1用pAG425GAL-ccdB+肌紅蛋白載體和空的PAG426GAL-ccdB載體進行了轉(zhuǎn)化。

篩選基于ura3和leu2互補性進行。轉(zhuǎn)化后的酵母在無Ura/Leu的葡萄糖合成完全培養(yǎng)基（United States Biological產(chǎn)品）（含2g酵母氮源、2g缺失氨基酸混合物、5g硫酸銨、30g葡萄糖，溶于1L SD-L-U+葡萄糖培養(yǎng)基，pH=6）中，以1.2倍重力、30°C條件培養(yǎng)24小時。將培養(yǎng)物稀釋至光密度OD600=0.6后，通過將培養(yǎng)基碳源從葡萄糖替換為半乳糖（1L培養(yǎng)基含30g）來誘導異源蛋白表達。

在SD-L-U+半乳糖培養(yǎng)基中，以25mg/L的FeSO4作為鐵源促進肌紅蛋白-鐵結(jié)合結(jié)構(gòu)的形成（通過定量RT-PCR的轉(zhuǎn)錄本豐度測定驗證，方法S1），免疫印跡和間接免疫熒光檢測，并在30°C、1.2×g條件下培養(yǎng)酵母細胞24小時。

氧氣轉(zhuǎn)運測定。酵母在磷酸二氫鉀緩沖液中洗滌兩次，然后懸浮于氮氣鼓泡的磷酸二氫鉀緩沖液中。酵母懸浮液用氮氣鼓泡30秒并真空處理30分鐘，以最小化酵母懸浮液中的可溶性氧氣，這對于維持脫氧肌紅蛋白的狀態(tài)至關(guān)重要。在氧氣耗盡和再通氣后掃描酵母懸浮液在500納米到600納米之間的光譜。與純化肌紅蛋白的光譜相比，酵母懸浮液的光譜表明高鐵肌紅蛋白的狀態(tài)可能優(yōu)于脫氧肌紅蛋白和氧合肌紅蛋白。此外，酵母細胞懸浮液的吸光度光譜預(yù)期比純化肌紅蛋白更復雜。盡管存在這些局限性，再通氣后A541的變化是明顯的，該變化在541-543納米范圍內(nèi)，即純化氧合肌紅蛋白在我們觀察中的吸收峰。A541的增加反映了脫氧肌紅蛋白在Fe2+-O2結(jié)合后轉(zhuǎn)化為氧合狀態(tài)，這可歸因于氧氣流入。A541的增加速率可以反映表達不同水通道蛋白的酵母菌株的氧氣吸收能力。因此，在分別加入1毫升空氣飽和的磷酸二氫鉀緩沖液或氮氣飽和的磷酸二氫鉀緩沖液作為陰性對照后，立即使用分光光度計在541納米處記錄每種菌株1毫升酵母懸浮液的吸光度2分鐘，間隔1秒。所有測量在22°C下進行。基于六次生物學重復計算平均值和標準誤。使用CM-H2DCFDA指示選定酵母菌株由于此類預(yù)處理后的氧化狀態(tài)，并測定選定水通道蛋白的過氧化氫轉(zhuǎn)運能力。

通過用分光光度計測量60秒內(nèi)A541的增加來篩選表達推定的氧氣轉(zhuǎn)運水通道蛋白的菌株后，為選定的菌株制備酵母原生質(zhì)體用于精煉的氧氣轉(zhuǎn)運測定。誘導后，收集每種菌株4毫升OD600=2的酵母培養(yǎng)物，預(yù)孵育、洗滌并用酶解酶在37°C、50轉(zhuǎn)/分鐘處理2小時。酵母原生質(zhì)體重懸于10毫升酶緩沖液中。對于初始的氧氣耗盡狀態(tài)，在將500微升原生質(zhì)體懸浮液與500微升等滲抗壞血酸鈉緩沖液混合后立即掃描從300納米到650納米的吸光度光譜。在30秒、90秒、150秒以及之后每分鐘直至第10分鐘的時間點，每次直接通氣30秒后進行連續(xù)掃描。在541-543納米處，氧合狀態(tài)的肌紅蛋白有一個明顯的吸收峰。在319-330納米處，肌紅蛋白和表達肌紅蛋白的酵母原生質(zhì)體在氧合狀態(tài)下都顯示出第二個更明顯的吸收峰，這在未轉(zhuǎn)化酵母菌株中不存在。A319/A341的值隨著多次通氣而急劇增加，表明ΔA319/ΔA341是肌紅蛋白氧合的良好指標。因此，計算ΔA541/ΔA600和ΔA319/ΔA341來表示由于肌紅蛋白氧合引起的吸光度變化。在90秒時酵母原生質(zhì)體的ΔA541/ΔA600中分析了所有菌株之間的統(tǒng)計學顯著差異，以及在5分鐘并通氣5次（每次30秒）后的ΔA319/ΔA341中。