由于脫氧肌紅蛋白向氧合肌紅蛋白的轉(zhuǎn)化是鐵依賴性的，并可能受細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的影響，使用CM-H2DCFDA測量了經(jīng)過氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)測定預(yù)處理后選定菌株的氧化還原狀態(tài)。CM-H2DCFDA產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度在氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)測定預(yù)處理后的酵母菌株之間沒有顯著差異。這表明在氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)測定之前，模擬、HsAQP1、NtPIP1;3和AtPIP1;2菌株中的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)相似。與早期報(bào)告類似，在NtPIP1;2菌株中檢測到過氧化氫通透性增加。然而，在NtPIP1;3、HsAQP1或模擬菌株中未測量到過氧化氫通透性增加，而在AtPIP1;2菌株中觀察到略高的熒光強(qiáng)度（提示過氧化氫通透性增加）在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著。

酵母氧氣消耗能力。異源表達(dá)NtPIP1;3和HsAQP1的酵母細(xì)胞分別顯示出比模擬對照高2.3倍和1.8倍的氧氣吸收速率，并且從溶液中消耗氧氣的速度顯著更快。表達(dá)AtPIP1;2的酵母細(xì)胞的氧氣吸收速率以及從溶液中耗盡氧氣的時(shí)間與模擬對照相比沒有顯著差異。異源表達(dá)水通道蛋白對酵母細(xì)胞直徑?jīng)]有顯著影響，在模擬、HsAQP1、NtPIP1;3和AtPIP1;2菌株中測量值分別為2.87±0.05、2.74±0.06、2.98±0.06和2.87±0.08微米（平均值，n=50±標(biāo)準(zhǔn)誤）。

圖5.酵母菌株在1000秒內(nèi)的氧氣消耗情況。(A)HsAQP1、NtPIP1;3、AtPIP1;2和模擬菌株（對照）的呼吸速率。(B)HsAQP1、NtPIP1;3、AtPIP1;2和模擬菌株（對照）的氧氣完全消耗時(shí)間。在向經(jīng)氮?dú)夤呐莸腟D-L-U+葡萄糖培養(yǎng)基中的酵母懸浮液供應(yīng)空氣，使其可溶性氧氣濃度達(dá)到飽和濃度235μmol L-1后，立即使用氧氣微傳感器監(jiān)測并每秒記錄酵母懸浮液中氧氣濃度的下降。星號表示與模擬菌株存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（下表顯示P值）（ANOVA,Tukey檢驗(yàn),P≤0.05,n=6±標(biāo)準(zhǔn)誤）。

低氧條件下煙草根中PIP轉(zhuǎn)錄豐度和ATP水平。我們檢測了在礦物溶液培養(yǎng)中遭受淹水誘導(dǎo)低氧處理兩天和七天的煙草植物的轉(zhuǎn)錄水平。經(jīng)過兩天低氧處理后，顯示高氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)速率的水通道蛋白NtPIP1;3在葉片和根中的轉(zhuǎn)錄水平比通氣良好的植物增加了約四倍。在通氣良好的植物中，葉片和根中的水通道蛋白轉(zhuǎn)錄水平在第二天和第七天保持相似。在葉片中NtPIP1;4以及根中NtPIP1;1和NtPIP1;2的轉(zhuǎn)錄水平也測量到相對較小的增加。七天后，在低氧葉片和根中測量到NtPIP1;3的急劇增加（分別比通氣對照高約12倍和22倍）。葉片中NtPIP2;1也有約三倍的增加。在低氧處理下，從第二天到第七天，葉片和根中的NtPIP1;3轉(zhuǎn)錄水平急劇增加，同時(shí)根尖段的ATP水平顯著增加。處理七天后，每個根段中低氧和通氣良好的根具有相似的ATP水平。低氧植物外觀健康翠綠，沒有出現(xiàn)缺氧癥或其他可見的氧氣缺乏跡象。

討論

在本研究中，我們通過測量肌紅蛋白峰值波長附近吸光度隨時(shí)間的變化，研究了水通道蛋白對酵母完整細(xì)胞和酵母原生質(zhì)體跨膜氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)的潛在貢獻(xiàn)。在完整細(xì)胞測定中，A541在前60秒內(nèi)增加，這使我們能夠篩選表達(dá)推定的氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)水通道蛋白的菌株。A541的變化可能代表幾個過程的組合，包括氧氣擴(kuò)散、脫氧肌紅蛋白的氧合、氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白之間的轉(zhuǎn)化以及氧氣消耗。細(xì)胞壁的存在可能會阻礙肌紅蛋白吸光度的變化，并在初步篩選中導(dǎo)致對氧氣擴(kuò)散的低估。此外，在混合酵母懸浮液和通氣緩沖液期間可能會對吸光度讀數(shù)造成假象。酵母原生質(zhì)體測定旨在通過眾多預(yù)防措施和更多重復(fù)來消除這些潛在缺陷，并最大化肌紅蛋白氧合的信號。結(jié)果表明，酵母原生質(zhì)體測定中的ΔA319/ΔA341也可能是測量氧氣通過水通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的高度敏感參數(shù)。

我們發(fā)現(xiàn)能通過促進(jìn)氧氣通道來增強(qiáng)肌紅蛋白氧合的人水通道蛋白HsAQP1，也曾被報(bào)道當(dāng)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中異源表達(dá)時(shí)能促進(jìn)二氧化碳轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，其他主要的二氧化碳轉(zhuǎn)運(yùn)水通道蛋白，包括AtPIP1;2、NtPIP1;2和LbAQP1，在酵母中表達(dá)時(shí)并未促進(jìn)氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)。這表明水通道蛋白直系同源物已經(jīng)發(fā)展出一定程度的氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)特異性。對所有分析的20種水通道蛋白的比對并未顯示氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)水通道蛋白獨(dú)有的共有殘基。看來保守殘基是物種依賴性的，而非與轉(zhuǎn)運(yùn)能力相關(guān)。然而，值得注意的是，所有六種氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)水通道蛋白在物種間具有高度保守的29個氨基酸殘基，包括大多數(shù)Asn-Pro-Ala簽名基序和Ar/R選擇性過濾器的殘基。在NtPIP1;3中，通常位于第二個NPA基序中的天冬酰胺殘基被蘇氨酸（Thr-235）取代，這可能與其高度增強(qiáng)的氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)能力潛在相關(guān)。

對疏水氣體（氧氣、二氧化碳和一氧化氮）滲透的計(jì)算一致顯示通過水孔的能量屏障值相似，為5-6千卡每摩爾。人類HsAQP1四聚體的膜蛋白模擬系統(tǒng)證明了在四個單體之間中心存在一個孔，該孔主要由疏水殘基排列，可能參與氣體而非水的轉(zhuǎn)運(yùn)?？梢酝茰y，該孔的存在及其精確結(jié)構(gòu)賦予了不同水通道蛋白氣體轉(zhuǎn)運(yùn)特異性。如果證明正確，該孔的門控特性可以作為靶點(diǎn)來改變跨膜氣體通過的速率。

酵母氧氣吸收速率的結(jié)果證實(shí)了氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)測定的結(jié)果，指出了孔介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)對呼吸作用的重要性。癌細(xì)胞中經(jīng)常報(bào)道HsAQP1轉(zhuǎn)錄水平增加，有時(shí)也伴隨其他水通道蛋白的增加，HsAQP1的表達(dá)水平通常與細(xì)胞生長、腫瘤分級和轉(zhuǎn)移相關(guān)。也有報(bào)道稱，刪除HsAQP1能有效減小乳腺腫瘤大小和肺轉(zhuǎn)移，并且HsAQP1沉默抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲性。雖然對HsAQP1表達(dá)與癌性生長之間聯(lián)系提出的解釋主要集中在水轉(zhuǎn)運(yùn)上，但也應(yīng)考慮快速生長的癌細(xì)胞對氧氣的高需求與HsAQP1促進(jìn)氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)之間的關(guān)聯(lián)。

圖6.暴露于通氣良好和低氧條件后，煙草質(zhì)膜內(nèi)在蛋白的轉(zhuǎn)錄豐度。(A)暴露2天后葉片中和(B)根中，以及(C)暴露7天后葉片中和(D)根中所選PIPs的相對轉(zhuǎn)錄豐度。PIPs的轉(zhuǎn)錄豐度通過qRT-PCR分析中的標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定，并針對兩個參考基因EF1-α和L25轉(zhuǎn)錄豐度的幾何平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。星號表示同一天通氣良好與低氧處理之間基因表達(dá)的顯著差異；下表列出了第2天與第7天之間比較的P值（ANOVA,Tukey檢驗(yàn),P≤0.05,n=6±標(biāo)準(zhǔn)誤）。

圖7.遭受低氧和通氣良好條件的煙草植株葉片以及根基部、根中部和根尖段的ATP水平。(A)處理2天后的ATP水平。(B)處理7天后的ATP水平。ATP水平通過檢測螢光素酶/螢光素反應(yīng)中的生物發(fā)光信號來確定。星號表示同一天同一組織中通氣良好與低氧處理之間ATP水平的顯著差異；下表列出了第2天與第7天之間比較的P值（ANOVA,Tukey檢驗(yàn),P≤0.05,n=6±標(biāo)準(zhǔn)誤）。

由于關(guān)于低氧誘導(dǎo)HsAQP1表達(dá)的報(bào)道表明水通道蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程在低氧條件下可能特別重要，我們檢測了煙草的轉(zhuǎn)錄水平。低氧導(dǎo)致七天后低氧和通氣良好植物的葉片和所有根段中ATP水平相似。結(jié)果表明，在經(jīng)歷初始低氧脅迫后，植物可能獲得了足夠的氧氣來支持有氧呼吸，因?yàn)榈脱踔参锿庥^健康翠綠，并且沒有表現(xiàn)出缺氧癥或其他可見的氧氣缺乏跡象。雖然某些植物對根低氧的抵抗可以通過形成特殊的通氣結(jié)構(gòu)（如通氣組織）來增加向根細(xì)胞的氧氣供應(yīng)來解釋，但在沒有明顯結(jié)構(gòu)變化的情況下植物對低氧抵抗的過程仍然不清楚。在我們的研究中，暴露于根低氧的植物根和莖中沒有出現(xiàn)可指示改善氧氣輸送的結(jié)構(gòu)特征。因此，NtPIP1;3轉(zhuǎn)錄水平的增加可能是促進(jìn)根通氣的重要因素之一，類似于低氧人體組織中HsAQP1轉(zhuǎn)錄水平的增加。顯然，孔介導(dǎo)的氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)與低氧之間的聯(lián)系值得進(jìn)一步關(guān)注。

總之，我們的結(jié)果表明，所研究的一些植物和人類水通道蛋白可能參與氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)。異源表達(dá)這些水通道蛋白的酵母細(xì)胞在液體培養(yǎng)中保持了更高的氧氣吸收速率，并且煙草植物在其根遭受低氧條件后，推定的氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)水通道蛋白急劇增加。這些氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)水通道蛋白在七天低氧處理后的增加伴隨著低氧根尖段ATP水平的增加。研究結(jié)果支持了孔介導(dǎo)的氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)的功能意義應(yīng)受到更多關(guān)注的觀點(diǎn)。