2.材料與方法

2.1.采樣

圖1.維戈河口地圖上的采樣點位置。

在維戈河口（圖1）進行了五個時間序列實驗，用水取自Toralla碼頭，時間跨越大洋涌升季節末期（夏末）和下沉流季節（秋季和冬季）的不同時間。

2.2.葉綠素a

在0、24和48小時測定葉綠素a濃度。初始葉綠素a樣品直接從50升聚乙烯桶中采集。將四個額外的50毫升瓶子和兩個125及570毫升瓶子與呼吸瓶一起培養，以測定24和48小時后的葉綠素a濃度。水樣（100-150毫升）通過0.2微米孔徑、直徑47毫米的聚碳酸酯濾膜過濾。濾膜立即冷凍。葉綠素a濃度使用Turner 10-AU熒光計測定，該熒光計用純葉綠素a標準品校準，樣品在4°C下用90%丙酮提取約24小時。

2.3.細菌豐度

在時間序列3-時間序列5中，在0、24和48小時測定細菌豐度。零時樣品直接從50升聚乙烯桶中采集。24和48小時樣品取自用于葉綠素a測量的相同額外培養瓶。5毫升海水通過0.2微米孔徑、直徑25毫米的聚碳酸酯濾膜過濾。細菌數量來源于DAPI混合染色細胞的顯微鏡計數得出的原核生物豐度。根據Teira等人的方法，DAPI混合物由5.5份Citifluor、1份Vectashield和0.5份含有DAPI（終濃度1微克/毫升）的磷酸鹽緩沖鹽水組成。

2.4.微型浮游生物豐度

在時間序列3-時間序列5中，在0、24和48小時分析微型浮游植物組成。零時樣品直接從50升聚乙烯桶中采集，而每個體積的一個額外瓶子與呼吸、葉綠素a和細菌計數瓶一起培養。樣品用盧戈爾溶液固定，終濃度為2%。根據Uterm?hl方法，使用倒置顯微鏡和25毫升沉降管對浮游植物生物進行計數和鑒定。

2.5.暗群落呼吸

暗群落呼吸通過以下兩種方法同時測定：（A）離散暗瓶培養后溶解氧的體外變化；（B）通過氧電極連續監測培養室中的氧濃度。

2.5.1.離散培養

使用硅膠管從50升聚乙烯桶中小心地裝滿三十六個經過重量校準、酸洗過的深色硼硅酸鹽玻璃瓶（每種體積：50、125和570毫升）。灌裝時讓水溢出，并特別注意硅膠管中氣泡的形成。對于每種瓶子體積，立即固定三個重復瓶子用于測定初始氧濃度，其余瓶子在恒溫室內的溫度控制水浴中于黑暗條件下培養。培養溫度是樣品原位溫度。在各自的培養期后（10到12個培養時間點），固定每種瓶子體積的三個重復瓶子。所有固定瓶子均被密封，保存在水浴中，并在固定后48小時內進行分析。溶解氧濃度通過使用Metrohm 721 DMS Titrino進行的自動化精密溫克勒滴定法測量，采用電位終點法。固定樣品的等分試樣使用10毫升溢流移液管移取。呼吸速率計算為零時樣品和培養樣品氧濃度平均值之差。

2.5.2.體外氧演化的連續監測

將80毫升硼硅酸鹽呼吸室裝滿來自50升聚乙烯桶的海水。呼吸室用帶有毛細孔的蓋子密封，以允許氧微傳感器進入。孔徑足夠小，以最小化室內樣品與水浴中水之間的氧氣交換。

溶解氧測量使用Unisense微呼吸系統進行，尖端內徑為500微米。電路接地以防止電極讀數上的高頻噪聲。每次測量前，使用兩點程序對微電極進行校準，以0%飽和溶解氧濃度（0.1 M抗壞血酸溶液和0.3 M NaOH溶液按50:50體積混合）和100%飽和溶解氧濃度（0.2微米過濾并劇烈鼓泡的海水）作為端點，在校準溫度下進行。

呼吸室放置在水下架子上，置于溫度控制水浴中，完全黑暗。在樣品制備過程中，觀察到水溫略有升高；因此，作為預防措施，由于傳感器對溫度變化高度敏感，將水浴溫度設定比原位溫度高0.2°C，從而最小化培養開始時可能出現的急劇溫度下降。

樣品浸入水浴后，將微電極插入呼吸室蓋子的毛細孔中，讀數穩定（60-90秒）后開始測量。氧濃度在48小時內每20秒記錄一次。氧消耗速率確定為氧濃度隨時間下降的斜率。

使用超純水進行的獨立測試表明，電極本身的耗氧量可以忽略不計。根據Briand等人的方法，并且由于單個微呼吸系統存在后勤困難，未使用重復。

由于在前兩次實驗中獲得的信號噪聲過大，微呼吸系統獲得的結果未在本文中展示。在時間序列5期間，冷卻系統的幾個電氣問題導致水浴夜間加熱；呼吸計記錄的異常氧數據被丟棄，直到水浴溫度再次達到初始溫度+0.2°C。

2.6.統計分析

為了評估三組瓶子體積的最小培養時間，進行了非參數檢驗U-Mann Whitney，因為重復次數少且方差齊性假設并非總是滿足。氧濃度與初始氧濃度首次出現顯著差異的培養時間被視為最小時間。呼吸速率的線性也通過此檢驗確定，通過比較每個培養期后測得的每小時呼吸速率與最小時間測得的每小時速率。當在某個時間的每小時呼吸速率與后續時間的速率之間檢測到統計學上的顯著變化時，前者被視為最大培養時間。

在我們的實驗中，呼吸速率不是獨立的，因為它們是由每個培養瓶的氧濃度減去初始氧濃度計算得出的。因此，為了研究三種不同瓶子大小在實驗過程中累積呼吸的差異，我們進行了重復測量方差分析檢驗，該檢驗允許在隨機樣本的所有成員在相同條件下測量時檢驗差異。

所有統計分析均使用SPSS軟件進行。