摘要

近期研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，其周圍的氧張力存在重要差異。由于氧氣在培養(yǎng)介質(zhì)中的擴(kuò)散速率較低，細(xì)胞正常呼吸會(huì)導(dǎo)致其周圍氧氣張力下降。因此，為了標(biāo)準(zhǔn)化和優(yōu)化培養(yǎng)條件，監(jiān)測(cè)細(xì)胞周圍氧張力和細(xì)胞耗氧量至關(guān)重要。本文描述了一種集成的氧微傳感器和記錄系統(tǒng)，用于測(cè)量覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)的1.6毫米深靜止介質(zhì)層垂直截面中的氧濃度分布。該測(cè)量裝置顯示，傳統(tǒng)的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物在匯合時(shí)，盡管暴露于環(huán)境空氣的恒定氧張力下，其細(xì)胞周圍氧張力可能會(huì)低于維持完全氧化代謝所需的水平。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)在降低的氧張力（低至約4%氧氣）下孵育時(shí)，消耗更為顯著且可能加劇。我們的結(jié)果表明，如果不測(cè)量細(xì)胞周圍氧張力，就不可能將體外培養(yǎng)結(jié)果（例如，基因表達(dá)）與細(xì)胞所經(jīng)歷的氧張力聯(lián)系起來，因?yàn)樵摑舛瓤赡芘c氣相中記錄的氧濃度存在非常大的偏差。

引言

長(zhǎng)期以來，人們已認(rèn)識(shí)到艾氏腹水癌細(xì)胞在培養(yǎng)中完全細(xì)胞呼吸的氧分壓下限為0.13 kPa（1300 ppm或1.3%O2）（Froese 1962）。這個(gè)下限僅僅是由于在較低的氧濃度下，細(xì)胞獲取氧分子的途徑受到限制，因?yàn)檠鯕庠谒芤褐械臄U(kuò)散速率很低（Boag 1970）。最近的研究進(jìn)展表明，培養(yǎng)物和組織中的細(xì)胞也可能通過復(fù)雜的基因調(diào)控反應(yīng)來應(yīng)對(duì)更溫和的缺氧，該反應(yīng)涉及許多基因的選擇性激活，其中大多數(shù)基因受缺氧反應(yīng)因子（HIF）的影響（綜述見Ebbesen等人2004或Hopfl等人2004）。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，控制細(xì)胞周圍氧張力的傳統(tǒng)方法是通過固定培養(yǎng)基上方氣相中的氧張力來實(shí)現(xiàn)（Wolff等人1993；Mamchaoui&Saumon 2000）。然而，細(xì)胞周圍張力還取決于培養(yǎng)基是否攪拌、特定培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)量及其代謝率，以及從培養(yǎng)基表面到培養(yǎng)瓶底部的擴(kuò)散距離（Chapman等人1970）。本文報(bào)告了：（i）我們的設(shè)備和方法使得能夠持續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞周圍氧張力，甚至檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞集落的局部效應(yīng)；（ii）在細(xì)胞培養(yǎng)單次傳代的正常過程中，盡管氣相中的氧濃度受控且保持恒定高位，細(xì)胞周圍氧張力仍會(huì)急劇下降；（iii）根據(jù)培養(yǎng)基中的氧張力分布計(jì)算的每個(gè)細(xì)胞的耗氧率。

材料與方法

細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞系T-47D（Keydar等人1979）作為單層培養(yǎng)物生長(zhǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco,Rockville,MD,USA）中，培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%胎牛血清（Gibco）、2 mM L-谷氨酰胺（Gibco）、200單位/升胰島素和1%青霉素/鏈霉素（Gibco）。T-47D細(xì)胞在環(huán)境空氣條件下的中位倍增時(shí)間為37小時(shí)（Stokke等人1993）。T-47D細(xì)胞表達(dá)野生型pRB，但p53基因在第194密碼子發(fā)生突變（Casey等人1991）。在第0天，將10^6個(gè)細(xì)胞接種在含有5毫升培養(yǎng)基的25平方厘米Beckton Dickinson Primaria培養(yǎng)瓶（Franklin Lakes,NJ,USA）中，并在含有5%CO2的4%或19%氧氣條件下的In Vivo 2400手套箱缺氧工作站中孵育。培養(yǎng)瓶瓶蓋打開以進(jìn)行氣體交換，但配備有過濾器以防止微生物進(jìn)入。

實(shí)驗(yàn)方案

測(cè)量貼壁培養(yǎng)細(xì)胞上方培養(yǎng)基中氧張力的技術(shù)平臺(tái)設(shè)有測(cè)量電極尖端位置的視覺顯示。因此，所有測(cè)量均在無需將培養(yǎng)物從培養(yǎng)箱中取出的情況下進(jìn)行。細(xì)胞接種密度為每25平方厘米培養(yǎng)瓶5x10^5個(gè)細(xì)胞，氣相為4%或19%，監(jiān)測(cè)持續(xù)5或7天，每天測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)物一次，一次電極垂直向下瞄準(zhǔn)，一次向相反方向。

測(cè)量裝置

用于測(cè)量氧氣微梯度的裝置（概覽見圖1）購(gòu)自丹麥優(yōu)尼森的Unisense A/S公司。它包括一個(gè)氧微傳感器，由電機(jī)驅(qū)動(dòng)并通過計(jì)算機(jī)控制的微操縱器固定，安裝在培養(yǎng)箱內(nèi)的倒置顯微鏡上。氧微傳感器（OX10 Clark型）尖端直徑為10微米（圖2），并配備保護(hù)陰極（圖中未顯示），以防止電解質(zhì)儲(chǔ)液器中的氧氣擴(kuò)散到氧傳感陰極（Revsbech 1989）。傳感器充滿電解質(zhì)以屏蔽信號(hào)免受電化學(xué)場(chǎng)干擾，因此無需使用噪聲屏蔽法拉第籠。使用時(shí)，氧氣通過硅膠尖端膜擴(kuò)散到氧還原陰極，該陰極相對(duì)于內(nèi)部Ag/AgCl陽極極化。從陽極到氧還原陰極的電子流線性反映了傳感器尖端近端的氧分壓。產(chǎn)生的微弱電流（10^-12至10^-10安培）由靈敏的皮安計(jì)PA2000測(cè)量。該皮安計(jì)配有兩個(gè)通道，并內(nèi)置極化源。

氧微傳感器通過安裝在倒置Olympus CK41顯微鏡金屬框架上的電機(jī)驅(qū)動(dòng)微操縱器定位（圖1）。電機(jī)驅(qū)動(dòng)微操縱器通過連接筆記本電腦的電機(jī)控制器（MC-232）進(jìn)行控制，筆記本電腦運(yùn)行Unisense Profix 3.05數(shù)據(jù)采集軟件。待研究的培養(yǎng)物放置在培養(yǎng)箱內(nèi)倒置顯微鏡的手動(dòng)操作XY顯微鏡載物臺(tái)上。培養(yǎng)瓶永久放置在電極下方，無攪拌，所有測(cè)量均在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行。讀數(shù)在培養(yǎng)箱外的屏幕上監(jiān)測(cè)，顯微鏡配備有數(shù)碼攝像機(jī)。圖片通過Olympus DP-Software程序直接獲取和存儲(chǔ)。由于測(cè)量時(shí)瓶蓋已移除，傳感器可以30度傾角插入而不干擾培養(yǎng)基。

傳感器校準(zhǔn)

對(duì)于每日實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行初始兩點(diǎn)校準(zhǔn)。零讀數(shù)是在含有抗壞血酸和氫氧化鈉終濃度均為0.1 M的鹽性堿性/抗壞血酸鈉溶液中獲得的。由于培養(yǎng)箱內(nèi)的氧分壓受控，第二個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)是在與箱內(nèi)大氣平衡的溶液中獲得的。校準(zhǔn)通過使用Profix數(shù)據(jù)采集軟件的校準(zhǔn)模塊完成。

耗氧量測(cè)量

在培養(yǎng)瓶中建立了穩(wěn)態(tài)線性氧梯度，其斜率與培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的呼吸速率成正比。通過測(cè)量覆蓋在培養(yǎng)瓶底部細(xì)胞上方的1.6毫米厚水相培養(yǎng)基層中連續(xù)等距測(cè)量點(diǎn)處的氧濃度，確定了附著在培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞產(chǎn)生的氧濃度梯度。氧濃度梯度以25微米的步長(zhǎng)進(jìn)行解析。測(cè)量既包括從培養(yǎng)基下降到底部細(xì)胞的過程，也包括重新上升通過培養(yǎng)基的過程。未觀察到滯后效應(yīng)。該軟件允許在數(shù)天內(nèi)以固定時(shí)間間隔自動(dòng)進(jìn)行剖面測(cè)量。通過顯微鏡跟蹤并拍攝傳感器的位置。每次讀數(shù)后，通過在無菌水中沖洗，隨后在70%乙醇中浸泡5分鐘，在手套箱內(nèi)對(duì)傳感器尖端進(jìn)行消毒。

基于氧濃度分布計(jì)算呼吸速率

薄層（1.6毫米）的培養(yǎng)基、上方缺乏空氣循環(huán)以及系統(tǒng)的溫度均勻性，導(dǎo)致細(xì)胞上方的培養(yǎng)基處于靜止?fàn)顟B(tài)。因此，通過該靜止層的氧氣傳輸完全基于分子擴(kuò)散，因?yàn)闆]有湍流、層流或其他培養(yǎng)基的整體運(yùn)動(dòng)。瓶底細(xì)胞的耗氧導(dǎo)致通過培養(yǎng)基的線性濃度梯度。微傳感器的耗氧量微不足道，因此不影響氧梯度。通過使用菲克第一擴(kuò)散定律（Crank 1975），可以根據(jù)傳感器測(cè)量的線性氧梯度估算流向細(xì)胞層的氧通量：J=-D*dC/dX，其中dC/dX是梯度的斜率，D是培養(yǎng)基的擴(kuò)散系數(shù)。在穩(wěn)態(tài)條件下，氧通量將等于覆蓋瓶底的細(xì)胞的呼吸速率。使用培養(yǎng)基表面下方400微米深度至瓶底上方100微米深度之間、顯示基本線性深度-氧氣濃度關(guān)系的測(cè)量值，通過線性回歸確定氧濃度梯度。耗氧率（nmol/h/cm2）的計(jì)算假設(shè)氧氣在培養(yǎng)基中的溶解度（約9‰鹽度，37.0°C）為200μmol/l（Garcia&Gordon 1992）。37.0°C時(shí)培養(yǎng)基中的擴(kuò)散系數(shù)約為3.37x10^-5 cm2/s。可以從Unisense網(wǎng)站http://www.unisense.com下載自動(dòng)進(jìn)行這些計(jì)算的Excel電子表格。呼吸速率以fmol O2/h/細(xì)胞表示，方法是將獲得的每平方厘米呼吸速率（根據(jù)上述公式1）除以每平方厘米的細(xì)胞數(shù)。每個(gè)瓶子中的細(xì)胞通過胰蛋白酶處理解離后，在Neubauer計(jì)數(shù)室中進(jìn)行計(jì)數(shù)。