摘要

近期研究發現，哺乳動物細胞在培養過程中，其周圍的氧張力存在重要差異。由于氧氣在培養介質中的擴散速率較低，細胞正常呼吸會導致其周圍氧氣張力下降。因此，為了標準化和優化培養條件，監測細胞周圍氧張力和細胞耗氧量至關重要。本文描述了一種集成的氧微傳感器和記錄系統，用于測量覆蓋細胞培養的1.6毫米深靜止介質層垂直截面中的氧濃度分布。該測量裝置顯示，傳統的貼壁細胞培養物在匯合時，盡管暴露于環境空氣的恒定氧張力下，其細胞周圍氧張力可能會低于維持完全氧化代謝所需的水平。當細胞培養在降低的氧張力（低至約4%氧氣）下孵育時，消耗更為顯著且可能加劇。我們的結果表明，如果不測量細胞周圍氧張力，就不可能將體外培養結果（例如，基因表達）與細胞所經歷的氧張力聯系起來，因為該濃度可能與氣相中記錄的氧濃度存在非常大的偏差。

引言

長期以來，人們已認識到艾氏腹水癌細胞在培養中完全細胞呼吸的氧分壓下限為0.13 kPa（1300 ppm或1.3%O2）（Froese 1962）。這個下限僅僅是由于在較低的氧濃度下，細胞獲取氧分子的途徑受到限制，因為氧氣在水溶液中的擴散速率很低（Boag 1970）。最近的研究進展表明，培養物和組織中的細胞也可能通過復雜的基因調控反應來應對更溫和的缺氧，該反應涉及許多基因的選擇性激活，其中大多數基因受缺氧反應因子（HIF）的影響（綜述見Ebbesen等人2004或Hopfl等人2004）。在細胞培養實驗中，控制細胞周圍氧張力的傳統方法是通過固定培養基上方氣相中的氧張力來實現（Wolff等人1993；Mamchaoui&Saumon 2000）。然而，細胞周圍張力還取決于培養基是否攪拌、特定培養物中的細胞數量及其代謝率，以及從培養基表面到培養瓶底部的擴散距離（Chapman等人1970）。本文報告了：（i）我們的設備和方法使得能夠持續監測細胞周圍氧張力，甚至檢測單個細胞集落的局部效應；（ii）在細胞培養單次傳代的正常過程中，盡管氣相中的氧濃度受控且保持恒定高位，細胞周圍氧張力仍會急劇下降；（iii）根據培養基中的氧張力分布計算的每個細胞的耗氧率。

材料與方法

細胞

人乳腺癌細胞系T-47D（Keydar等人1979）作為單層培養物生長于RPMI 1640培養基（Gibco,Rockville,MD,USA）中，培養基補充有10%胎牛血清（Gibco）、2 mM L-谷氨酰胺（Gibco）、200單位/升胰島素和1%青霉素/鏈霉素（Gibco）。T-47D細胞在環境空氣條件下的中位倍增時間為37小時（Stokke等人1993）。T-47D細胞表達野生型pRB，但p53基因在第194密碼子發生突變（Casey等人1991）。在第0天，將10^6個細胞接種在含有5毫升培養基的25平方厘米Beckton Dickinson Primaria培養瓶（Franklin Lakes,NJ,USA）中，并在含有5%CO2的4%或19%氧氣條件下的In Vivo 2400手套箱缺氧工作站中孵育。培養瓶瓶蓋打開以進行氣體交換，但配備有過濾器以防止微生物進入。

實驗方案

測量貼壁培養細胞上方培養基中氧張力的技術平臺設有測量電極尖端位置的視覺顯示。因此，所有測量均在無需將培養物從培養箱中取出的情況下進行。細胞接種密度為每25平方厘米培養瓶5x10^5個細胞，氣相為4%或19%，監測持續5或7天，每天測量每個培養物一次，一次電極垂直向下瞄準，一次向相反方向。

測量裝置

用于測量氧氣微梯度的裝置（概覽見圖1）購自丹麥優尼森的Unisense A/S公司。它包括一個氧微傳感器，由電機驅動并通過計算機控制的微操縱器固定，安裝在培養箱內的倒置顯微鏡上。氧微傳感器（OX10 Clark型）尖端直徑為10微米（圖2），并配備保護陰極（圖中未顯示），以防止電解質儲液器中的氧氣擴散到氧傳感陰極（Revsbech 1989）。傳感器充滿電解質以屏蔽信號免受電化學場干擾，因此無需使用噪聲屏蔽法拉第籠。使用時，氧氣通過硅膠尖端膜擴散到氧還原陰極，該陰極相對于內部Ag/AgCl陽極極化。從陽極到氧還原陰極的電子流線性反映了傳感器尖端近端的氧分壓。產生的微弱電流（10^-12至10^-10安培）由靈敏的皮安計PA2000測量。該皮安計配有兩個通道，并內置極化源。

氧微傳感器通過安裝在倒置Olympus CK41顯微鏡金屬框架上的電機驅動微操縱器定位（圖1）。電機驅動微操縱器通過連接筆記本電腦的電機控制器（MC-232）進行控制，筆記本電腦運行Unisense Profix 3.05數據采集軟件。待研究的培養物放置在培養箱內倒置顯微鏡的手動操作XY顯微鏡載物臺上。培養瓶永久放置在電極下方，無攪拌，所有測量均在培養箱內進行。讀數在培養箱外的屏幕上監測，顯微鏡配備有數碼攝像機。圖片通過Olympus DP-Software程序直接獲取和存儲。由于測量時瓶蓋已移除，傳感器可以30度傾角插入而不干擾培養基。

傳感器校準

對于每日實驗，進行初始兩點校準。零讀數是在含有抗壞血酸和氫氧化鈉終濃度均為0.1 M的鹽性堿性/抗壞血酸鈉溶液中獲得的。由于培養箱內的氧分壓受控，第二個校準點是在與箱內大氣平衡的溶液中獲得的。校準通過使用Profix數據采集軟件的校準模塊完成。

耗氧量測量

在培養瓶中建立了穩態線性氧梯度，其斜率與培養瓶中細胞的呼吸速率成正比。通過測量覆蓋在培養瓶底部細胞上方的1.6毫米厚水相培養基層中連續等距測量點處的氧濃度，確定了附著在培養瓶底部的細胞產生的氧濃度梯度。氧濃度梯度以25微米的步長進行解析。測量既包括從培養基下降到底部細胞的過程，也包括重新上升通過培養基的過程。未觀察到滯后效應。該軟件允許在數天內以固定時間間隔自動進行剖面測量。通過顯微鏡跟蹤并拍攝傳感器的位置。每次讀數后，通過在無菌水中沖洗，隨后在70%乙醇中浸泡5分鐘，在手套箱內對傳感器尖端進行消毒。

基于氧濃度分布計算呼吸速率

薄層（1.6毫米）的培養基、上方缺乏空氣循環以及系統的溫度均勻性，導致細胞上方的培養基處于靜止狀態。因此，通過該靜止層的氧氣傳輸完全基于分子擴散，因為沒有湍流、層流或其他培養基的整體運動。瓶底細胞的耗氧導致通過培養基的線性濃度梯度。微傳感器的耗氧量微不足道，因此不影響氧梯度。通過使用菲克第一擴散定律（Crank 1975），可以根據傳感器測量的線性氧梯度估算流向細胞層的氧通量：J=-D*dC/dX，其中dC/dX是梯度的斜率，D是培養基的擴散系數。在穩態條件下，氧通量將等于覆蓋瓶底的細胞的呼吸速率。使用培養基表面下方400微米深度至瓶底上方100微米深度之間、顯示基本線性深度-氧氣濃度關系的測量值，通過線性回歸確定氧濃度梯度。耗氧率（nmol/h/cm2）的計算假設氧氣在培養基中的溶解度（約9‰鹽度，37.0°C）為200μmol/l（Garcia&Gordon 1992）。37.0°C時培養基中的擴散系數約為3.37x10^-5 cm2/s。可以從Unisense網站http://www.unisense.com下載自動進行這些計算的Excel電子表格。呼吸速率以fmol O2/h/細胞表示，方法是將獲得的每平方厘米呼吸速率（根據上述公式1）除以每平方厘米的細胞數。每個瓶子中的細胞通過胰蛋白酶處理解離后，在Neubauer計數室中進行計數。