結果

圖3顯示了讀數直至極低氧張力下的線性響應。圖4是傳感器尖端精確接觸瓶底細胞的照片。圖5顯示了在第0天于25平方厘米瓶底接種50萬個細胞后第1、2、3和4天，以及接種100萬個細胞后第4和7天的氧分布（即氧張力隨瓶底上方高度的函數關系）。第0天接種50萬個細胞的培養物到第4天時為亞匯合狀態，并在瓶底均勻分布，細胞集落樣組裝之間存在小的開放區域（圖6）。接種100萬個細胞的培養物到第5天時肯定已匯合，到第7天時趨于超匯合（圖7）；作為腫瘤細胞系，T-47D細胞不受接觸抑制并不令人驚訝。在圖5中，可以看到分布最上部區域的偏移，此處傳感器尖端從氣相移動到首次接觸培養基表面。在分布的下部區域，對于第3和第4天，可以看到當測量尖端接近瓶底細胞集落之間（即開放區域）時的線性氧分布，但當從細胞集落表面進行測量時，分布呈曲線狀。這些結果證明了我們的傳感器可實現的測量靈敏度的范圍。

圖5. 傳統T-47D細胞培養獲得的氧張力分布（即氧張力隨培養瓶底部上方高度的函數關系）。第0天每個培養瓶接種5x10^6或10^2個細胞，隨后在含5% CO2的環境空氣中生長。符號○和□(a)以及△和?(b)分別代表第0天每瓶接種0.5x10^6個細胞的1、2、3和4天齡培養物。所有這些分布代表測量尖端直接下降至細胞集落頂部上方的測量結果。然而，對于3天和4天齡的培養物，也展示了測量尖端最終位于細胞集落之間的測量結果。這些測量結果以實線顯示，并出現在符號曲線的底部。(b)中的符號+和無符號的實線分別代表每瓶接種10^6個細胞的4天和7天齡培養物。注意匯合培養物在第4天和第7天培養期末期較低的細胞周圍氧張力。

圖8. 展示了接種5x10^5個細胞/瓶后，表面-底部氧張力差異隨接種后天數的函數關系。第7天的培養物細胞周圍張力降至氧化呼吸水平（1.3%）以下。空心圓圈顯示細胞在4%氧氣氣氛中生長，實心圓圈顯示在19%氧氣氣氛中生長。

在環境空氣氣相為19%氧氣的培養中，7天培養期間細胞周圍氧張力可能從體內生理缺氧值變為非生理性缺氧水平。氣相為19%和4%氧氣下的氧分布分析表明，在5天培養期間，細胞周圍張力類似（平行）下降，表面和底部張力之間的差異也類似增加（圖8和表1a）。然而，圖8顯示，在19%氧氣下培養4天后，表面-底部差異比在4%氧氣氣相/氧張力下增加更多。這可能表明在4%O2下氧氣供應不足以進行最大呼吸，而在19%O2下仍然足夠。耗氧量計算顯示，隨著培養期間細胞數量的增加，耗氧量如預期那樣增加。此外，我們發現當培養物變得非常密集時，每個細胞的耗氧量下降（表1b）。在這些謹慎條件下使用微傳感器，未發生培養物感染事件。

表1a. 從亞匯合狀態到完全匯合狀態的培養過程。比較在20%和4%氧氣濃度下培養5天的T-47D細胞周緣氧濃度的發展變化、氣相與細胞膜間氧濃度差異，以及第4天培養細胞的耗氧量。第0天，將5×10?個T-47D細胞接種于25平方厘米的Primaria培養瓶中。一個培養瓶用于連續氧濃度剖面測量，另一個作為對照僅在第4天進行一次剖面測量。細胞數量于第4天測定。此處展示了傳感器抵達培養基表面后的首次測量值、傳感器抵達培養瓶底部的末次測量值，以及兩者之間的差值。所有剖面測量均在細胞集落外緣完成，除細胞數量外所有數值均以氧氣百分比表示。

氣相	測試編號		第1天	第2天	第3天	第4天	第4天對照	第4天細胞數×10^6	消耗量 fmol/h/細胞
4% O2	1	頂部	3.87	3.90	3.68	3.52	3.51	3.00
		底部	3.24	2.86	1.69	0.54	0.53	對照:3.00	227
		差值	0.63	1.04	1.99	2.98	2.98
4% O2	2	頂部	4.00	4.01	3.96	4.18	3.85	4.28
		底部	3.40	2.96	1.75	0.60	0.40	對照:3.95	174
		差值	0.60	1.05	2.21	3.58	3.45
4% O2	3	頂部	3.73	3.87	3.77	3.50	3.51	5.09
		底部	2.90	2.25	0.74	0.31	0.26	對照:5.30	130
		差值	0.83	1.62	2.03	3.19	3.25
19% O2	4	頂部	19.12	17.97	18.76	18.38	18.22	3.38
		底部	18.68	17.16	17.06	14.84	14.46	對照:3.35	208
		差值	0.44	0.81	1.70	3.54	3.74
19% O2	5	頂部	18.91	19.19	19.15	18.92	18.80	4.52
		底部	18.37	18.24	17.32	14.71	14.24	對照:4.89	177
		差值	0.54	0.95	1.83	4.21	4.56

表1b：高細胞密度培養。在25平方厘米培養瓶中初始接種100萬個細胞且氣相氧濃度為19%的條件下，第4天達到融合狀態，第7天達到超融合狀態

匯合培養物		氧水平(%)	細胞數×10^7	氧消耗量 (fmol/h/細胞)
匯合培養物	頂部	17.63	1.37	146
	底部	7.51
	差值	10.12
超匯合培養物	頂部	17.39	2.49	127
	底部	0.75
	差值	16.64

討論

圖5所示氣體張力分布最上部（最頂端）部分的水平偏移反映了傳感器尖端首次接觸培養基表面的過渡點。兩個不同的現象解釋了氧張力的突然下降：

1.當傳感器接觸培養基表面的瞬間，由于表面張力，流體層被吸引到傳感器尖端周圍；這產生了一個局部表面“凸起”。因此，在培養基內的首次測量記錄的是相對于表面下方幾微米深度的濃度。當傳感器尖端更深地插入流體時，經驗得出的30度傳入傾角使這種表面張力效應消失。因此，流體柱上部400微米內等距步長的氧梯度不能被視為真實測量值，因此，這些部分曲線未用于最終計算。所描述的偽影在曲線上可見（圖5），其中上部400微米的梯度比在較低深度測量的梯度平緩。

2.與相同氧分壓下的靜止流體相比，氧微傳感器在氣相中給出的信號高出4%。因此，氣相中測量的氧分壓相對于靜止流體的校準被高估了4%。這種效應是由于空氣圍繞傳感器尖端時氧氣的擴散率更高所致。當傳感器尖端接近細胞聚集體時觀察到的曲線分布反映了靜止培養基層中真實的局部細胞周圍梯度。當傳感器尖端直接位于細胞集落上方時，描述局部氧張力變化的曲線，以及對應于靠近細胞聚集體的曲線，遠比培養基中較高位置時更為顯著。在基底上方較高處，分布變為線性；梯度反映了較大區域內的平均細胞密度，而不是由于細胞異質分布導致的局部濃度梯度。

培養基表面和瓶底之間的氧張力差異受氣相張力的影響很小，如圖8所示。這是預期的，因為這些培養物中的細胞周圍氧張力始終保持在完全呼吸所需水平（約0.1%O2）以上。然而，圖8表明差異更高，因此，在19%氧氣中培養4天后，梯度變得比在4%氧氣氣氛中更明顯一些。這可能與細胞集落周圍的局部梯度比瓶內較高處的整體梯度更顯著有關。如果局部梯度變化很大，這可能表明在4%O2氣氛下培養4天后氧氣獲取不足，而在19%O2下培養4天后則沒有這種缺乏。

我們的帶有程序化尖端下降的氧微傳感器系統提供了允許計算細胞周圍氧張力和耗氧量的分布。由于讀數可以編程為在固定時間間隔重復，細胞周圍氧張力和耗氧量測量可能成為組織培養的標準參數，其中穩定的細胞環境對于實驗的可重復性和/或優化細胞產品輸出非常重要。我們的監測經典細胞培養（生長附著于瓶底）的系統清楚地表明，如果不確定細胞周圍氧張力的變化，就不能簡單地通過給出培養期間使用的恒定氣相值來將體外培養結果與任何定義的氧張力聯系起來。

值得注意的是，在研究第4天，氣相含有4%氧氣的亞匯合培養物的平均每個細胞每小時耗氧量僅略低于含有19%氧氣的培養物，但在氣相中含有4%氧氣的超匯合培養物顯示出每個細胞的呼吸減少，盡管在這種情況下細胞周圍氧濃度（0.31%氧氣）高于Froese（1962）先前報告的完全呼吸下限。測試匯合的人包皮培養物，我們發現其耗氧量遠低于T-47D細胞和NHIK 3025細胞（結果未顯示）。在之前的許多實驗中已經測量了細胞周圍氧張力，并認識到了其重要性（Metzen等人1995）。在本研究中，我們的貢獻是對通過未受干擾的培養基的氧張力分布及其隨貼壁細胞群體增加而變化的量化。原則上，此類記錄可用于改變氣相氧張力，以抵消培養生長過程中細胞周圍氧張力的任何下降，目的是保持恒定的氧環境（正在進行的工作）。

結論

本文描述了一種集成的氧微傳感器和記錄系統，用于測量組織培養基垂直截面中的細胞周圍氧張力和氧通量。它已確定在貼壁細胞生長至匯合期間，盡管氣相中的氧張力恒定且充足，細胞周圍氧張力可能降至完全細胞氧合所需水平以下。考慮到過去十年發現的氧張力與細胞內部環境之間的密切關系，這意味著不同培養結果的標準化和比較需要直接測量細胞周圍氧張力。