2.3.物種組成和生物體積測定

用于物種鑒定和細胞大小測量的HRAM培養物子樣品在Phyco Tech納米浮游生物室中沉淀，并在Leica DMLB顯微鏡上以高達600倍的放大倍數觀察。微藻根據John等人的分類學描述鑒定到物種水平。對于物種計數，將1 mL HRAM培養物沉淀在Sedgwick rafter計數室中，在200倍放大倍數下觀察并計數所有存在的微藻。使用校準的目鏡測微尺進行細胞測量。根據分配給微藻屬的特定幾何形狀和方程式估算微藻細胞（不包括刺和粘液）的生物體積。

2.4.有機物和葉綠素生物量

對于有機物，將已知體積的HRAM培養物通過預先沖洗、預灼燒和預稱重的Whatman GF/F過濾器過濾，在105°C烘箱中烘干，冷卻后稱重以確定總懸浮固體濃度。然后將過濾器在450°C下灼燒4小時，在干燥器中冷卻并重新稱重以確定灰分濃度。有機物，也稱為揮發性懸浮固體，估算為TSS和灰分濃度之間的差值。對于葉綠素a和葉綠素b，將已知體積的HRAM培養物過濾到Whatman GF/F過濾器上，將過濾器在65.5°C的100%甲醇中煮沸5分鐘，然后在4°C黑暗條件下提取12小時。然后將樣品在3000 rpm下離心10分鐘，并在Shimadzu UV-2550分光光度計上讀取上清液的吸光度。使用甲醇的三色方程估算葉綠素a和葉綠素b濃度。

2.5.營養鹽和營養鹽去除效率

溶解營養鹽樣品通過Whatman GF/F過濾器過濾，銨態氮、硝態氮和溶解性活性磷的濃度根據標準方法比色測定。進水每單位微藻葉綠素a生物量去除營養鹽的效率，稱為營養鹽去除效率，通過以下公式確定：

NRE=[（進水濃度-出水濃度）/葉綠素a]×[1/停留時間（天）]

2.6.高速藻池光衰減和氣候

使用連接到LiCor Li-1000量子記錄儀（Li-Cor Biosciences,Lincoln,Nebraska,USA）的LiCor 2π水下傳感器測量每個HRAM水柱的光剖面。垂直光衰減系數通過下行輻照度對數與深度的回歸計算。水下光為表面光1%的光合作用帶深度從Kd估算。細胞每天在水柱中上下移動所經歷的總光量計算如下：

E_mix=[100×(1-e^{-K_d Z_mix})(K_d Z_mix)^{-1}]×日表面輻照度

其中Z_mix是高速藻池深度。基于生物量采樣前4天期間的平均E_mix根據日總表面輻照度確定。日表面輻照度在鄰近的氣象站記錄。

2.7.微藻光吸收和包裝效應

總顆粒光吸收在Shimadzu UV-2550分光光度計上使用積分球，在1 cm石英比色皿中測量，方法詳見Sutherland等人。微藻吸收系數aph(λ)m?1，確定為總顆粒吸收與碎屑吸收之差。單位總葉綠素a的比吸收系數a*_ph(λ)m2mg?1，通過將aph(λ)除以總葉綠素a計算得出。aph(675)是葉綠素a光吸收的量度，而a(440)是輔助色素和光保護色素光吸收的量度。

包裝效應是色素細胞的葉綠素比吸收系數a與相同細胞物質均勻分散在溶液中的比吸收系數a_sol之比。當a與a_sol之比為1時，沒有包裝效應，細胞內葉綠素的吸收是最佳的。當該比率向0減小時，包裝效應增加，光吸收是次優的。a_sol的比吸收系數在675 nm處假定為0.0207 m2mg?1，因此Qa(675)估算為：

Qa=a_ph(675)/0.0207

然后每個培養物的光譜平均葉綠素a比吸收系數計算如下：

ā=[∑_{400}^{700}a_ph(λ)E(λ)]/[∑_{400}^{700}E(λ)]

其中E(λ)是Hansatech光室的光譜輸出（詳見下文）。

2.8.光合參數

2.8.1.葉綠素熒光測量

使用葉綠素熒光對輻照度響應的快速光曲線評估CO?處理之間光合潛力的日變化。由于所需時間以及下午非常高的溶解氧濃度（>300%空氣飽和度）的干擾，全天進行光合作用測量（氧氣產生）不可行。然而，使用本實驗得出的數據，對所有HRAMs中暗適應微藻的最大電子傳遞速率和最大光合速率進行了比較，顯示這兩個變量之間存在強線性關系（R2=0.9442；圖1）。在本實驗的背景下，這種關系支持在無法測量P_max時使用ETR_max來證明光合潛力。

由于藻類濃度高、細胞沉降速率高以及避免攪拌對熒光測量的負面影響，使用潛水式PAM（Walz,Effeltrich,Germany）進行RLCs。對于每個RLC，將1 mL樣品在環境光條件下在不透明、無反射的比色皿中沉淀1分鐘，然后進行測量。通過將每個樣品暴露于初始暗步驟，然后八個遞增輻照度步驟，然后在每個步驟間隔結束時進行量子產額測量，來進行重復RLCs。輻照度步驟由PAM軟件程序控制，第一個輻照度步驟由用戶定義。每個輻照度步驟的間隔持續10秒，以最小化在測量過程中發生光誘導的可能性，并確保測量即時光合狀態。

電子傳遞速率計算如下：

ETR=(ΔF/F_m')×E×0.5×a*_ph

其中ΔF是在飽和輻照度下測量的最大熒光（F_m）減去閃光前的穩態熒光（F_m'），E是每個步驟的輻照度，0.5是乘法因子，因為假設吸收的光子有一半分配給光系統II。

ETR值在Sigmaplot（v11.0,SPSS Inc.）中作為PAR（根據RLC對照校準的LiCor 2π傳感器測量）的函數繪制，并使用Hennige等人修改自Jassby和Platt（1976；見下文）的以下模型擬合曲線，以得出ETRα和ETR_max：

ETR=ETR_max×[1-exp((-ETRα×E)/ETR_max)]

其中ETRα是最大光利用效率，從初始斜率得出，ETR_max是最大電子傳遞速率。ETR_Ek，光飽和強度，定義為光化學效率從光限制轉變為光飽和的光水平，從以下方程得出：

ETR_Ek=ETR_max/ETRα

每天在四個時間點（上午7:30、上午10:30、下午1:30和下午4:30）測量RLC，以評估ETR在不同輻照度條件下的有效性。

非光化學淬滅是過量光下被消散或淬滅的入射光子能量的量度，以防止光化學途徑受損。在與RLC測量相同的時間評估NPQ的日變化。NPQ通過以下方程計算：

NPQ=(F_m-F_m')/F_m'

使用潛水式PAM的RLC+恢復功能評估光系統II的恢復速率。在RLC之后，通過在暗暴露10、30、60、120、300和600秒后應用6個連續飽和脈沖來評估暗處產量和NPQ的恢復。恢復速率與RLC開始時測量的初始暗適應產量和NPQ值進行比較。在所有處理組以及對照組的兩個不同pH水平（pH 9和pH 10）下測量恢復速率，因為pH在一天中變化。

2.8.2.光合作用和最大量子產額

通過沿遞增輻照度梯度測量氧氣產生速率來確定初級生產力與輻照度曲線。將HRAM培養物等分試樣放入Hansatech氧電極室中，輻照度水平通過oxyLab32軟件程序（Hansatech Instruments Ltd.,UK）控制。使用在0%和100%空氣飽和水中校準的Clark型快速響應微傳感器（Unisense,Denmark）測量氧氣產生。輻照度曲線的總孵育時間為15分鐘，因為初步測量表明，當總孵育時間超過此時，pH迅速上升，氧氣產生下降（數據未顯示）。在光生物反應器藻類培養物中也觀察到了類似現象。

光合參數Pα和P_max通過使用Sigmaplot繪圖軟件（v 11.0）擬合Platt等人（1980）的公式，從重復的PE曲線估算：

P=P_max×[1-exp((-Pα×E)/P_max)]

其中Pα是PE曲線線性部分的斜率，顯示光限制條件下光合作用的效率，而P_max是PE曲線趨于平穩的點，代表光飽和條件下光合作用的最大速率。PE_k，光合作用的光飽和強度，定義為光合作用從光限制轉變為光飽和的光水平，從以下方程得出：

PE_k=P_max/Pα

最大量子產額定義了基于微藻吸收的光子能量的初級生產力速率。Φ_max表示每吸收光量子釋放氧分子的效率。Φ_max計算如下：

Φ_max=Pα/(43.2×ā*)

其中43.2將秒轉換為小時，毫克轉換為摩爾，微摩爾轉換為摩爾。

2.9.統計分析

必要時，對數據進行對數轉換以消除不對稱方差。使用方差分析和線性回歸進行統計分析。所有統計分析均使用Statistica（v10）軟件（Statsoft Inc.,Tulsa,OK,USA）進行。

3.結果

3.1.環境變量和溶解無機碳

在16天的培養期間，兩個實驗中各處理組和對照組之間的HRAM溫度沒有顯著差異（表1）。在兩個實驗中，所有四個處理組的pH通過在白天添加CO?氣體來控制。處理組的pH值顯著低于對照組（無CO?添加），對照組的中位值分別為pH 9.3（實驗1）和pH 9.5（實驗2；表1）。對于兩個實驗，溶解氧飽和度變化很大，通常范圍從所有HRAMs黎明前<50%空氣飽和度到所有四個處理組黃昏時>440%和對照組>330%（表1）。對照HRAMs中的DO顯著低于所有4個處理組（p<0.01）。兩個實驗中，溶解無機碳濃度隨著pH降低而顯著增加（表1）。各處理HRAMs中的DIC濃度在一天過程中沒有顯著差異，然而，兩個實驗中對照組HRAMs中的DIC隨著一天中pH升高而顯著降低（表1，圖2）。

表1- 兩個實驗中高速藻池中宇宙系統處理組的溫度、日間pH、溶解氧（DO）飽和度和溶解無機碳（DIC）濃度。數據為日間中位數±標準差。

參數		Control (pH>9)	pH 8	pH 7.5	pH 7	pH 6.5
實驗1	溫度 (°C) 中位數 ± s.d.	23.0±3.5	22.9±2.9	23.1±2.9	23.2±2.9	23.3±2.9
	min/max	15.9/26.7	16.0/26.8	16.2/26.8	16.4/26.8	16.3/26.6
	pH 中位數 ± s.d.	9.3±0.7	8.0±0.1	7.5±0.1	7.0±0.1	6.5±0.1
min/max	8.1/10.7	7.9/8.1	7.4/7.6	6.9/7.1	6.4/6.6
DO (%) 中位數 ± s.d.	192±88	260±120	307±130	313±125	281±117
min/max	28/333	45/440	54/496	52/444	50/447
DIC (mg/L) 中位數 ± s.d.	154±127	456±18	551±11	675±21	978±17
min/max	23/441	421/470	537/570	649/690	963/1011
實驗2	溫度 (°C) 中位數 ± s.d.	25.8±3.1	25.5±3.3	25.2±3.6	25.5±3.8	25.6±3.8
	min/max	18.9/30.5	18.7/30.2	18.9/30.4	18.8/30.4	18.7/30.7
	pH 中位數 ± s.d.	9.5±0.8	8.0±0.1	7.5±0.1	7.0±0.1	6.5±0.1
min/max	8.3/11.2	7.9/8.1	7.4/7.6	6.9/7.1	6.4/6.6
DO (%) 中位數 ± s.d.	209±96	308±150	348±141	333±116	321±126
min/max	31/349	47/457	53/471	49/460	48/447
DIC (mg/L) 中位數 ± s.d.	135±145	453±22	535±25	669±34	965±21
min/max	15/403	421/482	502/556	639/715	945/985