背景與目的

視網(wǎng)膜的視桿細(xì)胞外段是進(jìn)行光轉(zhuǎn)導(dǎo)的特化細(xì)胞器。線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物I-IV、細(xì)胞色素c以及FoF1-ATP合酶在視桿細(xì)胞外段盤(pán)膜上均有功能性表達(dá)。本研究旨在探究一些作為線粒體ATP酶/合酶抑制劑的多酚類化合物對(duì)視桿細(xì)胞外段異位FoF1-ATP合酶的作用。同時(shí)，通過(guò)研究細(xì)胞色素c、caspase 9、caspase 3以及Apaf-1的表達(dá)，探討了視桿細(xì)胞外段中的細(xì)胞凋亡機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)方法

我們從新鮮牛視網(wǎng)膜中制備了視桿細(xì)胞外段。采用了半定量Western blotting、共聚焦和電子顯微鏡、細(xì)胞流式術(shù)以及生化分析（如測(cè)氧法、ATP合成與水解測(cè)定）等方法。

主要結(jié)果

白藜蘆醇以及姜黃素聯(lián)合胡椒堿抑制了視桿細(xì)胞外段中的ATP合成和耗氧量。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和槲皮素抑制了視桿細(xì)胞外段中的ATP水解和耗氧量。在有底物存在的情況下，呼吸中的視桿細(xì)胞外段會(huì)產(chǎn)生丙二醛和過(guò)氧化氫。細(xì)胞色素c定位于盤(pán)膜內(nèi)部。Procaspase 9、procaspase 3以及Apaf-1在視桿細(xì)胞外段中均有表達(dá)。

結(jié)論與意義

這些多酚類植物化學(xué)物質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)視桿細(xì)胞外段的FoF1-ATP合酶活性，減少了由視桿細(xì)胞外段異位電子傳遞鏈產(chǎn)生的活性氧中間體。多酚類物質(zhì)能減少膜過(guò)氧化和細(xì)胞色素c從盤(pán)膜中的釋放，從而阻止視桿細(xì)胞外段中caspase依賴性細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。這些效應(yīng)對(duì)于設(shè)計(jì)針對(duì)因暴露于強(qiáng)光照射導(dǎo)致氧化應(yīng)激后視桿細(xì)胞外段功能損傷的保護(hù)策略具有重要意義。

縮寫(xiě)

AMD，年齡相關(guān)性黃斑變性；Ap5A，二（腺苷）-5'-五磷酸；ATP合酶，F(xiàn)oF1-ATP合酶；CLSM，共聚焦激光掃描顯微鏡；Cyt c，細(xì)胞色素c；DR，糖尿病視網(wǎng)膜病變；EGCG，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；ETC，電子傳遞鏈；OS，外段；PUFA，多不飽和脂肪酸；ROI，活性氧中間體；RP，視網(wǎng)膜色素變性；TEM，透射電子顯微鏡。

引言

氧化應(yīng)激是視網(wǎng)膜退行性疾病發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)主要因素，包括與光感受器相關(guān)的病變，如年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變。由于視網(wǎng)膜具有比其他組織更高的代謝率，光感受器消耗的氧氣大約是其他視網(wǎng)膜或中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的四倍，因此氧氣對(duì)于光感受器的存活至關(guān)重要。暗適應(yīng)的外層視網(wǎng)膜有高水平的氧氣利用。這與我們之前的蛋白質(zhì)組學(xué)和生化分析結(jié)果一致，即分離的視桿細(xì)胞外段盤(pán)膜中表達(dá)并具有異位FoF1-ATP合酶、電子傳遞鏈和細(xì)胞色素c的活性。視桿細(xì)胞外段本身可能是外層視網(wǎng)膜高耗氧量的原因。最近的數(shù)據(jù)顯示，短波長(zhǎng)光（藍(lán)光）照射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)視桿細(xì)胞外段的影響大于對(duì)光感受器內(nèi)段的影響，這強(qiáng)化了這一觀點(diǎn)。不僅是含有線粒體的內(nèi)段，視桿細(xì)胞外段也是介導(dǎo)藍(lán)光誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的活性氧中間體的來(lái)源。電子傳遞鏈?zhǔn)腔钚匝踔虚g體的主要來(lái)源，并且視桿細(xì)胞外段膜脂質(zhì)易于氧化，因?yàn)樗鼈兒蟹浅８吆康亩嗖伙柡椭舅?。?dāng)多不飽和脂肪酸被氧化時(shí)，會(huì)引發(fā)細(xì)胞毒性氧化還原鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致活性氧中間體產(chǎn)生和氧化應(yīng)激。

已知盤(pán)膜通過(guò)細(xì)胞凋亡死亡，但其成因尚不明確。觸發(fā)caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的一條通路是凋亡小體的形成，涉及細(xì)胞色素c對(duì)caspase 9的激活及其與胞質(zhì)Apaf-1的結(jié)合。我們之前的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，細(xì)胞色素c在盤(pán)膜中表達(dá)，并且盤(pán)膜中的ATP合酶是朝外取向的?？紤]到細(xì)胞色素c的朝向與ATP合酶F1部分的朝向相反，這提出了一個(gè)可能性：任何由于電子傳遞鏈功能過(guò)度活躍導(dǎo)致的盤(pán)膜暴露于氧化應(yīng)激，都可能允許細(xì)胞色素c從盤(pán)膜內(nèi)腔逸出。

一些多酚類植物化學(xué)物質(zhì)是顯示強(qiáng)效抗氧化作用的天然化合物。它們也作為ATP合酶抑制劑發(fā)揮作用。線粒體ATP合酶顯示兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。F1，一個(gè)由五個(gè)亞基組成的水溶性催化復(fù)合物，催化位點(diǎn)位于β亞基上；以及Fo，由幾種膜蛋白組成，因此包含寡霉素敏感性賦予蛋白。當(dāng)質(zhì)子順其濃度梯度流動(dòng)時(shí)，F(xiàn)o的c亞基環(huán)順時(shí)針旋轉(zhuǎn)驅(qū)動(dòng)ATP合成。逆時(shí)針移動(dòng)時(shí)則執(zhí)行ATP水解（ATP酶活性）。由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，ATP合酶被許多不同的天然和合成抑制劑所抑制。天然抑制劑是F1的蛋白質(zhì)抑制劑，一種在去能條件下結(jié)合F1的堿性蛋白，旨在保存細(xì)胞ATP。外源性ATP合酶抑制劑已被描述，包括efrapeptin、寡霉素、金擔(dān)子素B和疊氮化物。靶向F1的抑制劑efrapeptin的結(jié)合口袋位于α和β亞基，而金擔(dān)子素B的結(jié)合口袋主要在β亞基。

白藜蘆醇是一種天然的芪類植物抗毒素，是靶向F1組分的ATP合酶抑制劑。它通過(guò)結(jié)合在α和β亞基之間來(lái)影響ATP酶和ATP合酶活性。一類由植物產(chǎn)生的類黃酮相關(guān)多酚化合物，黃酮類，包括槲皮素、山奈酚、桑色素和芹菜素，也抑制線粒體ATP合酶的ATP水解活性，但不抑制ATP合成活性。山奈酚、桑色素和芹菜素對(duì)ATP酶活性的抑制作用與槲皮素相似，盡管后者的抑制效力約為前者的一半。兒茶素是另一類在綠茶中含量豐富的多酚化合物，包括表兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。后兩者是ATP水解的抑制劑。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯具有極強(qiáng)的抗氧化特性。姜黃素是印度咖喱香料中的活性成分，是一種從姜黃中提取的多酚，這種香料在南亞食品中廣泛使用。它也作為F1催化頭部的抑制劑發(fā)揮作用。

在此，我們報(bào)道白藜蘆醇、姜黃素、槲皮素和表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯抑制在視桿細(xì)胞外段中表達(dá)的異位ATP合酶，影響其ATP酶或ATP合酶活性或兩者。它們也抑制視桿細(xì)胞外段的耗氧量。這似乎與視桿細(xì)胞外段表達(dá)功能性ATP合酶的假說(shuō)一致，也與這些化合物對(duì)許多視網(wǎng)膜病變產(chǎn)生的有益效應(yīng)一致。我們還在盤(pán)膜內(nèi)部發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素c，并在視桿細(xì)胞外段中發(fā)現(xiàn)了procaspase 9、procaspase 3和Apaf-1。