方法

樣品制備

視網膜提取。如先前所述提取視網膜。簡言之，從新鮮摘除的牛眼球（從當地認證屠宰場獲得）中，在去除玻璃體和晶狀體后，將包含視網膜的眼杯半體，在哺乳動物林格氏液中孵育10分鐘。然后每張視網膜用剪刀從視神經上切下并收集。

純化的牛視桿細胞外段制備。在暗紅光照下于4°C，通過蔗糖/菲可連續梯度離心，從14個視網膜制備純化的牛視桿細胞外段，過程中存在蛋白酶抑制劑混合物和氨芐青霉素。視桿細胞外段制品的質膜完整性按早期報道進行表征。視桿細胞外段勻漿通過Potter-Elvehjem勻漿器在冰上于1:1（w/v）低滲介質中制備。

滲透壓完整的視桿細胞外段盤膜制備。通過菲可漂浮法從純化的視桿細胞外段制備滲透壓完整的盤膜。讓視桿細胞外段在含有亮抑蛋白酶肽和氨芐青霉素的5%菲可水溶液中于4°C爆裂3小時后，將樣品加樣到菲可上，懸浮液離心2小時。在無菌條件下，在水和菲可界面收集盤膜。

視桿細胞外段和盤膜純化過程均在缺乏環孢素A和2-氨基乙基二苯基硼酸酯（線粒體通透性轉換孔開放的抑制劑）的情況下進行。這樣的條件促進污染物線粒體（如果有的話）中線粒體通透性轉換孔的形成，從而使它們失去功能。

視網膜線粒體富集制品的分離。通過差速離心技術從制備視桿細胞外段后的殘留視網膜中分離牛視網膜線粒體富集部分。沉淀儲存于-80°C。所有步驟在4°C進行。

透射電子顯微鏡

對于切片的免疫染色，采用包埋后免疫金方法。切片首先用封閉溶液處理，然后與小鼠抗視紫紅質單克隆抗體或山羊抗caspase-3 p11多克隆抗體或兔抗caspase-9 p10多克隆抗體或兔抗ATP合酶β亞基多克隆抗體在4°C孵育過夜。抗體結合使用耦聯了金顆粒的二級抗體兔抗山羊IgG或山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG檢測。切片在FEI Tecnai G12透射電子顯微鏡下分析。陰性對照中，用預免疫血清代替特異性一抗應用于切片。圖像用Tietz TVIPS F114和OSIS Veleta相機拍攝，收集并用Corel Draw X3排版。通過省略一抗進行對照，結果顯示無交叉反應性。

電泳、半定量Western印跡和定量

變性電泳使用Laemmli方案在8-20%梯度膠上進行。SDS-PAGE后，樣品電轉移至硝酸纖維素膜上，并與一抗孵育：小鼠抗牛視紫紅質單克隆抗體、兔抗細胞色素c多克隆抗體、兔抗procaspase 9多克隆抗體、山羊抗procaspase 3多克隆抗體和兔抗Apaf-1多克隆抗體。抗視紫紅質用PBS 1:1000稀釋，抗procaspase 9、抗procaspase 3和抗細胞色素c用PBS 1:200稀釋，而抗Apaf-1用PBS 1:500稀釋。辣根過氧化物酶偶聯的二抗抗小鼠IgG、抗兔和抗山羊IgG抗體用PBS 1:10,000稀釋。使用Chemi-Doc XRS+進行定量光密度分析。

盤膜的共聚焦激光掃描顯微鏡

按報道的方法分批標記盤膜。使用總共2μg/mL的抗細胞色素c作為一抗。二抗是Alexa 488標記的抗兔IgG。在倒置LEICA TCS SP5 AOBS共聚焦激光掃描顯微鏡上進行CLSM成像。僅與二抗孵育的對照樣品顯示出可忽略的免疫反應性。

視桿細胞外段ATP合成測定

在視桿細胞外段中，根據Mangiullo等人的方法進行從ADP和無機磷酸生成ATP的反應。將視桿細胞外段在37°C孵育5分鐘。通過加入底物在混合物相同pH下誘導ATP合成。用終濃度為7%的高氯酸終止反應后，通過熒光素/熒光素酶化學發光法在發光儀中測量每個樣品中的ATP濃度，使用10^-9至10^-7 M的ATP標準溶液進行校準。必要時，孵育介質中含有30μM白藜蘆醇或不同濃度的姜黃素加胡椒堿。

過氧化氫產生測定

使用發光分析評估過氧化氫的產生。將視桿細胞外段勻漿樣品在37°C孵育10分鐘。孵育后，離心樣品，加入過氧化物酶和魯米諾后，通過發光法評估上清液中的過氧化氫產生。使用10至40μM的過氧化氫標準溶液校準曲線測量過氧化氫濃度。

丙二醛測量

使用硫代巴比妥酸反應物質測定試劑盒評估視桿細胞外段勻漿中的丙二醛濃度，該工具用于生物樣品中丙二醛的直接定量測量。首先將樣品或丙二醛標準品在95°C與TBA反應，然后在532nm進行分光光度測定。通過與丙二醛標準曲線比較確定樣品中的丙二醛含量。

視桿細胞外段ATP水解測定

通過丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶系統測定視桿細胞外段的ATP酶活性，其中ATP水解與NADH的氧化偶聯，在340nm監測。加入視桿細胞外段至反應混合物中。然后通過加入ATP誘導ATP水解。每分鐘測量吸光度值，持續10分鐘。必要時，向反應混合物中加入不同濃度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯或槲皮素。

氧耗測量

使用配備電流敏感電極的恒溫控氧儀裝置，在23°C密閉小室中測量視桿細胞外段的耗氧量，在連續電磁攪拌條件下進行。使用特定軟件將數據轉換為Excel文件。視桿細胞外段預先在超純水中稀釋，然后通過漢密爾頓注射器加入混合物，這導致視桿細胞外段部分破裂，允許底物滲透。孵育介質為HEPES，pH 7.3，含有KCl、MgCl2、KH2PO4、氨芐青霉素和Ap5A以抑制腺苷酸激酶。呼吸底物為NADH和琥珀酸。必要時，加入姜黃素加胡椒堿、表沒食子兒茶素沒食子酸酯或槲皮素。

細胞流式測量

使用JC-1和TMRM進行視桿細胞外段膜極化的細胞流式測量。使用親脂性陽離子探針JC-1和TMRM可以評估線粒體膜電位的變化，隨著電位增加，它們可逆地改變顏色。這是由于膜極化時JC-1聚集體的可逆形成，導致JC-1單體發射從530nm變為590nm，對應于J聚集體的發射。綠色和橙色/紅色發射在流式細胞儀中分別檢測。對于TMRM，綠色熒光信號通過530/30帶通濾光片收集，橙色熒光通過585/42帶通濾光片收集。視桿細胞外段在PBS中洗滌并重懸于HEPES緩沖液中，用JC-1或TMRM染色20分鐘，室溫保存，用PBS洗滌并重懸于PBS總體積中。在配備三個激光燈的CyAn ADP細胞儀中進行流式細胞術。所有物理參數的圖用于設置限制碎片和聚集體的門。常規分析每個樣品一萬個細胞，結果報告為相對于顯示熒光偏移的相關對照的細胞百分比。在典型實驗中，每個樣品制備為染色或未染色，包括無藥物（未處理樣品）和藥物處理樣品。

數據分析

結果以平均值±標準差表示，n指任何特定條件下的測定次數。在ATP合成/水解測定中，使用Student t檢驗進行統計分析，比較使用不同濃度多酚獲得的數據與對照樣品中獲得的數據。P < 0.05認為結果顯著。

材料

氨芐青霉素、Ap5A、姜黃素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、寡霉素、哇巴因、胡椒堿、槲皮素和白藜蘆醇均由Sigma-Aldrich供應。