結果

由于我們之前在分離純化的視桿細胞外段盤膜中發現了活躍的ATP合酶，并且其他人報道多酚類植物化學物質作為線粒體ATP合酶和ATP酶活性的抑制劑，我們 prompted 測試其中一些化合物對視桿細胞外段中ATP產生或水解的影響。牛視網膜視桿細胞外段以完整視桿細胞外段的形式純化，仍包含胞質、質膜和盤膜囊泡，如同體內狀態。我們之前對視桿細胞外段組分的表征排除了線粒體和內段的污染，并且最近的數據證明純化的視桿細胞外段通過線粒體外的氧化磷酸化消耗氧氣并合成ATP。

圖1、牛視網膜透射電鏡圖，檢測ATP合酶表達。(A-B) 用抗視紫紅質抗體（大，40納米直徑金顆粒；箭頭）和抗ATP合酶β亞基抗體（小，10納米直徑金顆粒；箭頭）雙標記的牛視網膜。(A)中的方框區域在(B)中放大，顯示視桿細胞外段（OS）中視紫紅質和ATP合酶信號共定位的細節，以及相鄰內段（IS）中的線粒體（m），該處僅表達ATP合酶。(C) 一個視桿細胞外段的細節。

在此，我們進行了牛視網膜的免疫金TEM成像。在視桿細胞外段中發現了視紫紅質與ATP合酶β亞基的共定位（圖1A）。圖1B是雙標記視桿細胞外段部分的放大圖，顯示視紫紅質信號（40nm直徑金顆粒）與ATP合酶信號（10nm直徑金顆粒）的共定位。圖1C顯示同一雙標記視網膜內段的線粒體，在圖1D中放大，顯示僅存在ATP合酶信號。

圖2、通過半定量Western印跡分析表征分離的視桿細胞外段。(A和B) 使用抗視紫紅質（Rh）和抗ATP合酶β亞基抗體進行的半定量Western印跡。樣品來自分離的視桿細胞外段（OS）和線粒體富集部分（M）。(C) 使用ChemiDoc軟件（Bio-Rad Laboratories）進行的光密度分析。每個面板代表至少五次實驗。

圖2中的Western印跡分析數據證實了圖1所示的結果，即視紫紅質存在于視桿細胞外段中（圖2A），但不存在于用作陰性對照的線粒體中。ATP合酶β亞單位同時存在于視桿細胞外段和線粒體中（圖2B），光密度分析證實了這一點（圖2C）。

圖3、使用寡霉素和白藜蘆醇在純化的視桿細胞外段中進行ATP合成。柱狀圖顯示在37°C，pH 7.3條件下，視桿細胞外段（40 μg·mL?1）在1分鐘內的ATP生成量。加入10 μM寡霉素和30 μM白藜蘆醇分別抑制了90%和98%的ATP產量。數據顯示為平均值±標準差，n=4。*P < 0.01，配對Student t檢驗。

ATP合酶在視桿細胞外段中具有催化活性，圖3顯示了視桿細胞外段勻漿的ATP合成。在存在NADH、琥珀酸鹽和ADP的情況下，檢測到最大活性為每分鐘每毫克蛋白質產生0.430±0.060微摩爾ATP。ATP合成是特異性的，因為它被寡霉素（90%）抑制，寡霉素是經典的線粒體ATP合酶抑制劑。這種ATP合成也被白藜蘆醇抑制（98%，圖3）。

為了測試白藜蘆醇損害盤膜質子電位的能力，該化合物也用于先前用TMRM或JC-1（兩種線粒體膜電位探針）標記的視桿細胞外段的細胞流式分析。表1報告了在存在NADH和琥珀酸鹽或加入白藜蘆醇后，使用視桿細胞外段勻漿獲得的結果。對照顯示TMRM和JC-1的均勻信號，表明存在膜電化學電位，如早期報道。與白藜蘆醇孵育30分鐘并未降低膜電位。在不同時間點進行的測量長達1小時未顯示膜極化顯著降低。

圖4、使用姜黃素和胡椒堿在純化的視桿細胞外段中進行ATP合成。柱狀圖顯示在37°C，pH 7.3條件下，視桿細胞外段（40 μg·mL?1）在1分鐘內的ATP生成量。(A) 加入100 μM姜黃素以及100 μM姜黃素加100 μM胡椒堿抑制了ATP產量。(B) 加入200、100、50或25 μM的姜黃素和胡椒堿組合抑制ATP合成。數據顯示為平均值±標準差，n=4。*P < 0.01，配對Student t檢驗。

姜黃素單獨使用或與胡椒堿聯合使用對視桿細胞外段ATP產生的影響顯示在圖4A中。姜黃素（100μM）單獨使用時抑制ATP合成，但與胡椒堿（也使用100μM）聯合使用增加了抑制。這種組合（使用相等濃度）的效果是濃度依賴性的（圖4B）。

圖5、使用EGCG和槲皮素在純化的視桿細胞外段中進行ATP水解。柱狀圖顯示在37°C，pH 7.3條件下，視桿細胞外段（40 μg·mL?1）在1分鐘內的ATP水解量。(A) 在不同濃度下，EGCG或(B)槲皮素抑制視桿細胞外段制備物中的ATP水解。數據顯示為平均值±標準差，n=4。*P < 0.01，配對Student t檢驗。