由于我們先前報(bào)道視桿細(xì)胞外段中的ATP合酶和ATP酶代表同一蛋白質(zhì)，即異位ATP合酶，因此在存在表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和槲皮素的情況下測(cè)定ATP酶活性，以測(cè)試它們對(duì)視桿細(xì)胞外段ATP水解活性的抑制作用，如對(duì)線粒體ATP合酶的報(bào)道。如圖5A和5B所示，每種化合物都表現(xiàn)出濃度依賴性的ATP水解抑制。盡管我們實(shí)驗(yàn)中的視桿細(xì)胞外段經(jīng)過(guò)純度檢查并且似乎不含內(nèi)段和質(zhì)膜蛋白質(zhì)，但ATP酶測(cè)定是在存在哇巴因（Na+/K+ ATP酶抑制劑）和EDTA（Ca2+-ATP酶抑制劑）的情況下進(jìn)行的，以防止其他ATP酶活性的貢獻(xiàn)。

圖6、在存在姜黃素、EGCG或槲皮素的情況下測(cè)量純化視桿細(xì)胞外段的呼吸速率。視桿細(xì)胞外段中耦合呼吸速率的代表性電流記錄軌跡。添加物為NADH（0.2 mM）、琥珀酸鹽（20 mM）和ADP（0.1 mM）。然后在(A)中加入姜黃素和胡椒堿（各100 μM）；在(B)中加入EGCG（100 μM）；在(C)中加入槲皮素（100 μM）。反應(yīng)體積為1.7 mL，使用約40 μg總視桿細(xì)胞外段蛋白。

多酚類化合物也影響了視桿細(xì)胞外段的耗氧率。在存在NADH和琥珀酸鹽作為呼吸底物的情況下，在視桿細(xì)胞外段中測(cè)量的ADP刺激耗氧量的代表性電流記錄軌跡顯示在圖6中。加入姜黃素加胡椒堿（圖6A）或表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（圖6B）或槲皮素（圖6C）使ADP刺激的耗氧量分別降低了約61%、76%和78%。我們已經(jīng)報(bào)道白藜蘆醇抑制視桿細(xì)胞外段耗氧量。

在存在不同呼吸底物（丙酮酸/蘋果酸、NADH、琥珀酸鹽）的情況下，測(cè)量了視桿細(xì)胞外段產(chǎn)生過(guò)氧化氫的能力。數(shù)據(jù)報(bào)告在表2中。

由于盤膜脂質(zhì)可能因異位電子傳遞鏈產(chǎn)生的活性氧中間體而過(guò)氧化，還評(píng)估了視桿細(xì)胞外段膜中丙二醛的產(chǎn)生。在存在NADH的情況下，丙二醛產(chǎn)生為每分鐘每毫克蛋白質(zhì)0.14納摩爾，而在沒(méi)有NADH的對(duì)照樣品中，為每分鐘每毫克蛋白質(zhì)0.05納摩爾。

圖7、細(xì)胞色素c在盤膜中的表達(dá)。(A) 細(xì)胞色素c的Cy3間接熒光共聚焦激光掃描顯微鏡圖像。(B) (A)中所示盤膜的透射圖像。(C) 盤膜（D）和線粒體富集部分（M）中視紫紅質(zhì)（Rh）的半定量Western印跡分析。(D) 盤膜（D）和線粒體富集部分（M）中細(xì)胞色素c的半定量Western印跡分析。(E) 使用ChemiDoc軟件（Bio-Rad Laboratories）進(jìn)行的光密度分析。每個(gè)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；n=5。

我們?cè)缙谟械鞍踪|(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)表明細(xì)胞色素c在分離純化的盤膜中表達(dá)，這里我們證實(shí)了它在分離的視桿細(xì)胞外段盤膜內(nèi)部的存在。根據(jù)我們的標(biāo)記技術(shù)對(duì)用抗細(xì)胞色素c抗體標(biāo)記的盤膜進(jìn)行的CLSM成像顯示盤膜未被標(biāo)記。實(shí)際上檢測(cè)不到熒光信號(hào)（圖7A），盡管盤膜在透射圖像中可見(jiàn)（圖7B）。相比之下，Western印跡顯示細(xì)胞色素c在盤膜以及用作陽(yáng)性對(duì)照的線粒體中表達(dá)（圖7D），并且細(xì)胞色素c的朝向通常與ATP合酶F1部分的朝向相反。盤膜對(duì)視紫紅質(zhì)的存在呈陽(yáng)性染色（圖7C）。結(jié)果通過(guò)光密度分析總結(jié)（圖7E）。

圖8、procaspase 9、procaspase 3和Apaf-1的半定量Western印跡分析。(A-C) 抗procaspase 9、procaspase 3和Apaf-1抗體的半定量Western印跡信號(hào)。樣品為分離的視桿細(xì)胞外段（OS）和線粒體富集部分（M）。(D) 使用ChemiDoc軟件（Bio-Rad Laboratories）進(jìn)行的光密度分析。每個(gè)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；n=6。

細(xì)胞色素c在盤膜內(nèi)部的表達(dá)意味著對(duì)盤膜的任何損傷，例如由電子傳遞鏈產(chǎn)生的活性氧中間體導(dǎo)致的多不飽和脂肪酸氧化，可能將這種蛋白質(zhì)釋放到視桿細(xì)胞外段胞質(zhì)溶膠中。這將導(dǎo)致由凋亡小體激活介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，觸發(fā)caspase依賴性細(xì)胞死亡通路。因此，我們證實(shí)了凋亡小體在視桿細(xì)胞外段中的存在及其可能的激活。圖8顯示procaspase 9（圖8A）、procaspase 3（圖8B）和Apaf-1（圖8C）同時(shí)存在于視桿細(xì)胞外段和用作陽(yáng)性對(duì)照的胞質(zhì)部分中。數(shù)據(jù)通過(guò)對(duì)用與Western印跡相同抗體標(biāo)記的牛視網(wǎng)膜切片進(jìn)行免疫金TEM實(shí)驗(yàn)證實(shí)（圖9）。免疫反應(yīng)性procaspase 3和procaspase 9明顯存在于視桿細(xì)胞外段中，它們與免疫反應(yīng)性視紫紅質(zhì)信號(hào)共定位。兩種抗procaspase 3和9抗體也標(biāo)記了內(nèi)段線粒體。類似地，在視桿細(xì)胞外段和內(nèi)段線粒體中觀察到免疫反應(yīng)性Apaf-1。

圖9、牛視網(wǎng)膜透射電鏡圖。Procaspase 3 (A-C)、procaspase 9 (D-E) 和 Apaf-1 (F-H) 的表達(dá)。(A-E) 視網(wǎng)膜用抗視紫紅質(zhì)（Rh；大，40納米直徑金顆粒；箭頭）和抗procaspase 3或抗procaspase 9（小，10納米直徑金顆粒；箭頭）抗體雙標(biāo)記。(A-B) 視桿細(xì)胞外段制備物。(A)中的方框區(qū)域在(B)中放大，顯示同時(shí)表達(dá)視紫紅質(zhì)和procaspase 3的視桿細(xì)胞外段盤膜。(C) 內(nèi)段（IS）中三個(gè)表達(dá)procaspase 3的線粒體（m）。(D) 一個(gè)同時(shí)表達(dá)Rh和procapsase 9的視桿細(xì)胞外段。(E) 視桿細(xì)胞外段（左）和內(nèi)段（右）之間的連接區(qū)域。在視桿細(xì)胞外段盤膜中，抗Rh和抗procaspase 9共定位；在線粒體（m）中，僅可見(jiàn)procaspase 9。(F-G) 顯示Apaf-1表達(dá)（箭頭）的視桿細(xì)胞外段（左）和內(nèi)段（右）之間的連接區(qū)域，Apaf-1在視桿細(xì)胞外段和內(nèi)段中均有表達(dá)。(F)中的方框區(qū)域在(G)中放大，顯示一個(gè)標(biāo)記的線粒體以及靠近纖毛基體（bb）的胞質(zhì)溶膠。(H) 一個(gè)表達(dá)Apaf-1（箭頭）的視桿細(xì)胞外段。