討論與結論

目前的數據表明，在視桿細胞外段中，白藜蘆醇和姜黃素抑制ATP合酶活性，而槲皮素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯抑制ATP酶活性。這與顯示多酚（包括姜黃素、白藜蘆醇、槲皮素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯）作為線粒體ATP合酶的ATP酶和/或ATP合酶活性抑制劑的報道一致。值得注意的是，在我們的實驗系統中，這些化合物也能夠抑制視桿細胞外段的耗氧量，表明它們可以影響氧化磷酸化過程。我們的數據與視桿細胞外段表達功能性ATP合酶的假說一致，如先前報道。這一發現的意義通過觀察到所有多酚都不能進入完整的線粒體而得到強調，線粒體需要經過 detergent 處理或超聲處理才能測量多酚對其ATP酶或ATP合酶活性的影響。

多酚對幾種威脅視力的視網膜疾病可能產生有益作用已被報道。我們的假設是，多酚對視網膜的保護作用主要是通過靶向視桿細胞外段中的線粒體外ATP合酶來介導的。由于ATP合酶的F1部分朝向視桿細胞外段盤膜的外部，多酚化合物將直接接觸其在盤膜ATP合酶F1部分上的結合位點。

抗氧化療法降低了氧化應激相關的年齡相關性黃斑變性的發病率，并且在大鼠糖尿病視網膜病變模型的體內研究中顯示出口服姜黃素具有直接益處。姜黃素被認為是治療和預防年齡相關性黃斑變性和糖尿病視網膜病變的有效化合物，然而這種功效僅在高劑量下顯示，具有潛在的副作用。我們的數據顯示姜黃素的抗氧化作用通過與胡椒堿共同給藥而增強，表明后者不僅通過阻斷其代謝降解來提高姜黃素的生物利用度，而且可能涉及其藥理作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯與硝普鈉的眼內注射顯示對視網膜光感受器具有保護作用。口服表沒食子兒茶素沒食子酸酯減少了光誘導的視網膜神經元死亡，表明在預防光感受器細胞死亡方面具有一定功效。在體內，槲皮素治療減少了激光誘導的年齡相關性黃斑變性模型中脈絡膜新生血管的大小。

白藜蘆醇阻斷ATP合酶F1部分的作用方式類似于內源性F1抑制劑和金擔子素B的作用方式，兩者都是線粒體ATP合酶的抑制劑。由于ATP合酶是一種納米馬達，這些化合物通過插入F1部分的α和β亞基之間來抑制ATP合酶。有趣的是，細胞流式數據顯示白藜蘆醇并未消除視桿細胞外段盤膜中的質子電位（表1）。這證實了白藜蘆醇不會永久滅活ATP合酶的發現，因為它是F1部分的可逆抑制劑，因為其結合發生在水相中。

表1、通過細胞流式分析測量視桿細胞外段膜電位

數據顯示來自極化視桿細胞外段（作為對照）與用白藜蘆醇（RV; 30 μM）處理的視桿細胞外段的比較。純化的視桿細胞外段（2.5 mg·mL?1）與0.29 mM NADH和20 mM琥珀酸鹽孵育。它們分別用TMRM或JC-1染色（視桿細胞外段對照）。所示值為陽性染色細胞百分比（平均值±標準差；n=4）。與白藜蘆醇（OS+RV）孵育并未顯著改變染色細胞的比例，顯示視桿細胞外段制備物的膜電位沒有變化。

通過這種方式，白藜蘆醇將不會作為清除型抗氧化劑起作用，而是作為電子傳遞鏈內電子通量的調節劑。由于電子傳遞鏈與ATP合成偶聯以維持膜完整性，電子傳遞鏈產生的活性氧中間體與其功能成正比。白藜蘆醇將通過可逆地抑制ATP合酶而不消除質子電位，間接降低電子傳遞鏈活性和營養利用，調節活性氧中間體的產生。這種在葡萄和葡萄酒中發現的酚類物質，據報道在大鼠和小鼠模型中能減少糖尿病視網膜病變中的血管病變和氧化應激。白藜蘆醇對損傷誘導的毛細血管變性的保護作用也已得到證實。用白藜蘆醇處理整個細胞數天，部分恢復了Fanconi貧血線粒體代謝活性，同時降低了野生型細胞的攝氧量。N,N'-二環己基碳二亞胺和寡霉素的作用不同，因為它們作用于脂質相的Fo部分。

表2、視桿細胞外段制備物產生過氧化氫

該表結果顯示，視桿細胞外段制備物能夠從一系列不同的呼吸底物產生過氧化氫，例如丙酮酸/蘋果酸混合物（pyr/mal）、NADH和琥珀酸鹽。數據顯示為平均值±標準差；n=5。

我們的數據顯示過氧化氫是在純化的視桿細胞外段中產生的，是其呼吸能力的直接結果（表2），并且丙二醛（一種公認的脂質過氧化生物標志物）的水平在存在NADH（呼吸復合物I的底物）的情況下增加。那么，視桿細胞外段中存在活躍的電子傳遞鏈應被視為活性氧中間體產生的主要部位。事實上，呼吸復合物I是活性氧中間體的主要來源。這支持了盤膜脂質因異位電子傳遞鏈產生的活性氧中間體而過氧化的理論。在持續光照的情況下，預計外節中電子傳遞鏈的功能會加快，這將產生更多的活性氧中間體。這與報道的數據一致，即當光轉導被持續激活時，如在連續強藍光照射期間，視桿細胞外段中的氧化應激增加。

在光誘導視網膜變性的大鼠模型中，補充姜黃素對活性氧中間體的產生具有神經保護作用。槲皮素誘導細胞遷移和管形成（年齡相關性黃斑變性特征性視網膜血管生成中的重要步驟）的濃度依賴性抑制，并減少細胞氧化損傷和衰老，抑制視網膜細胞培養物中的活性氧中間體產生。活性氧中間體在視網膜變性過程（如年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、白內障和青光眼）中的關鍵作用已被提出，因為光感受器對氧化應激特別敏感。

抗氧化劑似乎延緩或抑制變性過程的研究進一步支持了活性氧中間體產生和氧化應激參與光感受器細胞凋亡。細胞凋亡似乎是視網膜幾種疾病中看到的細胞丟失的原因，包括視網膜色素變性、青光眼和黃斑變性。在視網膜色素變性中，光感受器通過涉及caspase-9和caspase-3激活的內在凋亡通路死亡。

總之，我們的數據提示了多酚類植物化學物質可能的作用分子機制，即通過調節視桿細胞外段中的線粒體外ATP合酶來減少活性氧中間體的產生。在病理條件下，氧化磷酸化的解偶聯功能或功能性電子傳遞鏈超負荷可能損害盤膜，導致細胞色素c釋放，觸發視桿細胞中典型的細胞凋亡，如視網膜色素變性和年齡相關性黃斑變性。需要進一步的研究來評估對視網膜視桿細胞中ATP合酶的調節是否是多酚化合物的主要作用方式。這將為在氧化應激相關視網膜病變的治療中使用此類化合物作為輔助治療提供科學驗證。