光序批式反應器（Photo-SBR）

構建了三個實驗室規模的SBR，使用可編程邏輯控制器按進水、混合、曝氣、閑置、沉降和排水階段操作。反應器在室溫下運行，周期為12小時，包括進水、厭氧階段、好氧階段、缺氧階段、好氧階段、沉降和排水。兩個反應器填充了AnoxKaldnes生物膜載體。第三個沒有介質的反應器用作陰性對照。反應器以12小時水力停留時間和30天懸浮固體停留時間運行。pH未控制，在12小時SBR周期內范圍從7.4到8.1。所有三個SBR在厭氧、好氧和缺氧階段使用頂置式攪拌器進行混合。

圖3-1. 基于微藻的IFAS（MAIFAS）SBR及兩個對照（IFAS SBR和無IFAS介質的藻類SBR）示意圖

在實驗之前，首先使用合成廢水將兩個IFAS反應器接種活性污泥60天，以在K1介質上形成硝化生物膜。在此期間，所有三個反應器顯示71%至>99%的氨氮去除率，66%至97%的COD去除率和>99%的總磷去除率。觀察到K1介質上形成生物膜后，第一階段開始，向MAIFAS和懸浮對照SBR中添加500 mg L?1的普通小球藻。接種藻類的SBR在好氧階段暴露于熒光燈光照。在第一階段，向所有反應器供應空氣以培養硝化菌。設計葉綠素a與生物量比率高于10.25 mg g?1，以通過綠藻向系統提供足夠的氧氣進行硝化；然而，即使在75天后，葉綠素a與生物量比率仍低于6 mg g?1，因此調整廢水組成以促進微藻生長。氨氮和磷濃度分別增加到70 mg N L?1和20 mg P L?1，而COD降低到150 mg L?1。在第二階段，關閉藻類反應器的空氣供應，以評估微藻光曝氣的能力。SBR在第二階段條件下運行75天。

分析方法

在排水階段每周兩次從出水中取樣進行水質分析。樣品使用45 μm玻璃纖維過濾器過濾，并分析pH、氨氮、總磷和化學需氧量。使用pH和氨氮探頭測量pH和氨氮。使用Hach方法8180測量總磷，使用Hach方法8000測量COD。每個采樣點處理重復樣品。

另外，在12小時SBR周期內每小時取樣，分析硝酸鹽、亞硝酸鹽和溶解氧。使用鎘還原法測量硝酸鹽和亞硝酸鹽。使用DO探頭測量DO。

使用標準方法測定懸浮生物量。使用修改版的SM10200 H.2.b.方法測量葉綠素a，用于監測藻類生長。簡而言之，將5 mL樣品以13,000 rpm離心10分鐘。棄去上清液，向剩余沉淀物中加入5 mL的96%甲醇。將該混合物渦旋10分鐘，并在60°C下孵育15分鐘。然后將樣品在4°C冷卻30分鐘，并以13,000 rpm離心10分鐘。使用分光光度計測量上清液在666和653 nm處的吸光度，根據方程確定葉綠素a。

葉綠素 a (mg/L) = 15.65 A??? - 7.34 A???

其中A???是光在666 nm處的吸光度，A???是光在653 nm處的吸光度。

微剖面分析

使用DO微電極（尖端直徑：50 μm）和pH微電極（尖端直徑：10 μm）（UNISENSE A/S，丹麥）測量DO濃度和pH微剖面。使用按照Lewandowski描述的方法制造的氨離子選擇性微電極（尖端直徑：30 μm）測量氨濃度微剖面。DO微電極在相應的氧飽和（曝氣：在23°C下為8.6 mg O?/L）和氧耗盡（氮氣鼓泡：0% DO）的合成廢水中進行校準。pH微電極在標準緩沖溶液（pH 4, 7, 和 10，Fisher Scientific, Hampton, NH）中進行校準。氨微電極在具有不同氯化氨濃度的合成廢水中進行校準。每次剖面測量前后都對微電極進行校準。

對于微剖面測量，從反應器中取出一個K1生物膜載體，使用手術刀（一次性手術刀10號，Thermo Scientific, Waltham, MA）輕輕切成兩半，并放置在一個定制的流通池中，該流通池允許廢水以2 mL/min的流速流過生物膜（Lee et al. 2009）。使用夾具（VTHH, Veleman Inc., Fort Worth, TX）將樣品固定到位。使用三維（3D）微操縱器（UNISENSE A/S，丹麥）完成微電極尖端在樣品中的定位和移動，并使用帶有CCD相機的立體顯微鏡（World Precision Instruments, Sarasota, FL）進行觀察。將Ag/AgCl參比電極（MI-401, Microelectrodes Inc.）使用輔助手（VTHH, Veleman Inc., Fort Worth, TX）和實驗室千斤頂（Model 110, Swiss Boy lab jack, Fisher Scientific）定位在流通池中，以將生物膜置于立體顯微鏡視野中心。微剖面測量在法拉第籠（81-334-04, Technical Manufacturing Co. Peabody, MA）中進行，以最大限度地減少電氣干擾。在剖面測量期間，使用熒光燈向微藻集成固定生物膜載體提供76.2 μmol m?2 s?1的光照（與MAIFAS SBR操作相同）。實驗設置的照片如圖B2所示。微剖面測量從K1介質上方3,000 μm處開始，到介質表面結束，每100 μm進行一次測量，每次測量之間間隔5秒。每個參數測量兩個重復剖面。

Illumina測序

DNA和RNA提取、PCR和高通量擴增子測序

如前所述（Pitkanen et al. 2013），從5個MAIFAS（接種微藻的反應器）和3個IFAS（對照反應器）生物膜樣品中提取總RNA和DNA，并進行了一些微小修改。簡而言之，使用AllPrep DNA/RNA Mini Kit（Qiagen GmbH, Hilden, Germany）提取總核酸。使用Ambion TURBO DNA-free DNase Kit（Life Technologies, Grand Island, NY）進一步純化RNA。使用Qubit 2.0熒光計分別配合Qubit RNA和dsDNA HS檢測試劑盒（Life Technologies, Grand Island, NY）測定RNA和DNA的濃度和純度。使用隨機六聚體引物的Superscript III系統進行RT-PCR（Life Technologies, Grand Island, NY）生成cDNA。將樣品（cDNA和DNA）在-20°C下保存，直至用于下一代測序。使用cDNA和DNA作為模板，分別生成針對細菌16S核糖體RNA基因（rDNA）和轉錄本（rRNA）的獨立文庫。我們使用如Caporaso等人（2011）所述的帶條形碼的16S rRNA基因靶向引物（即515F和806R），并使用Illumina MiSeq PE250測序試劑盒（Caporaso et al. 2011）對目標產物（即291 bp）進行雙向測序。測序在辛辛那提兒童醫院醫學中心DNA測序和基因分型核心設施進行。