摘要

通過四種不同的測定方法（包括鐵螯合、2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除以及抑制脂質(zhì)氧化）測試了七種不同豬組織水解產(chǎn)物（結(jié)腸、闌尾、直腸、胰腺、心臟、肝臟和肺）的抗氧化能力。所有水解組織在四種測定中均顯示出抗氧化能力，其中結(jié)腸、肝臟和闌尾是抑制脂質(zhì)氧化最有效的三種組織（分別為47、29和27 mmol/L Trolox等效抗氧化能力），而肝臟、結(jié)腸、胰腺和闌尾是四種最有效的鐵螯合劑（分別為92% ± 1.1, 79.3% ± 3.2, 77.1% ± 1.8, 和 77% ± 2.3）。此外，結(jié)腸和闌尾顯示出良好的自由基清除能力，ABTS清除率分別為86.4% ± 2.1 和 84.4% ± 2.9，DPPH清除率分別為17.6% ± 0.3 和 17.1% ± 0.2。我們的研究結(jié)果為多種動物副產(chǎn)品的抗氧化能力提供了新知識，這些副產(chǎn)品可轉(zhuǎn)化為具有抗氧化活性的水解產(chǎn)物，從而創(chuàng)造附加值。 doi:10.1002/fsn3.106

引言

氧化是導致食品變質(zhì)的主要原因之一，會引起風味、質(zhì)地和顏色的不良變化。氧化通過破壞維生素和亞油酸、亞麻酸等必需脂肪酸，損害食品的營養(yǎng)質(zhì)量。此外，研究表明，在飼料中攝入氧化油會導致雞體內(nèi)產(chǎn)生氧化應激。因此，保護食物和生物體免受過度氧化至關(guān)重要。添加或保留現(xiàn)有的抗氧化劑是實現(xiàn)這一目標的方法之一。

作為生物活性水解產(chǎn)物和/或多肽的來源，體外受控酶解食品蛋白質(zhì)的應用正日益受到關(guān)注。通過選擇特定的酶，可以將母體蛋白質(zhì)水解，產(chǎn)生多種具有不同活性的肽。這些活性包括抗氧化、抗菌、抗高血壓和抗癌等活性。肉類工業(yè)產(chǎn)生大量低價值的副產(chǎn)品，從這些材料中釋放的生物活性肽有可能被用作功能性食品中的有益成分或食品中的天然防腐劑。由于丁基羥基茴香醚和丁基羥基甲苯等合成抗氧化劑顯示出潛在的致癌性，目前在許多國家其使用受到限制。它們可以有利地被源自水解副產(chǎn)物和其他肌肉食品的抗氧化肽所取代。由于其來源于人類長期食用的食品，此類水解產(chǎn)物被視為天然成分/防腐劑。迄今為止，已有報道從雞、魚、牛胸肉蛋白、豬血紅蛋白、豬皮明膠和豬肌原纖維蛋白中分離出抗氧化肽。

在本研究中，我們通過一系列測定不同抗氧化機制（鐵螯合、ABTS自由基清除、DPPH自由基清除和乳狀液中的脂質(zhì)氧化）的試驗，檢測了從七種化學組成差異很大的豬組織中獲得的水解產(chǎn)物的抗氧化能力，以評估（1）這些副產(chǎn)品作為抗氧化劑的有用性，（2）組織之間的差異，以及（3）任何潛在抗氧化能力的潛在機制。

材料與方法

化學品

Protamex 和 Alcalase 2.4 L FG 購自諾維信公司（丹麥，鮑斯韋）。磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、extran neutral MA02、ABTS 和過硫酸鉀購自 Merck 公司（德國，達姆施塔特）。硫酸亞鐵和 Ferrozine 購自 Sigma-Aldrich 公司（美國，圣路易斯）。DPPH、Trolox、抗壞血酸鈉、鹽酸、亞油酸甲酯和 Tween-20 購自 Sigma-Aldrich 公司（德國，施泰因海姆）。氯化血紅素購自 Acros Organics 公司（比利時，吉爾）。乙醇購自 Chemethyl A/S 公司（丹麥，克厄）。氫氧化鈉購自 Sigma-Aldrich 公司（德國，倫寧根）。

水解產(chǎn)物的制備

豬的結(jié)腸、闌尾、直腸、胰腺、心臟、肝臟和肺組織從屠宰場收集，并在使用前儲存在4°C。將來自數(shù)只動物的器官初步絞碎（孔徑3毫米），每種組織取約1千克與水按1:1（重量/重量）混合，然后在攪拌下在水浴中加熱至55°C。加入 Protamex 和 Alcalase 2.4 L FG 的1:1混合物，使最終酶與底物比例為1:1000（重量/重量），反應在55°C下進行2小時。通過在95°C下加熱樣品10分鐘來終止水解。樣品在 Rotafix 32A Hettich 離心機中以2000g離心5分鐘，以去除脂質(zhì)和不溶性蛋白質(zhì)。隨后將澄清的水相在-20°C下冷凍直至使用。

干物質(zhì)測定

使用水分分析儀測定干物質(zhì)含量，通過測量樣品在130°C下的水分損失直至恒重。每次分析使用約3克樣品。

乳狀液中脂質(zhì)氧化的抑制

氧消耗率的測定按照 Hu 和 Skibsted（2002年）的方案進行，并作了一些修改。將亞油酸甲酯與Tween 20及恒溫（25°C）的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）混合，加入20 μL抗氧化劑溶液和25 μL 0.20 mmol/L血紅素水溶液以啟動氧化反應。總體積為2.8 mL。作為陽性空白對照，用20 μL乙醇替代抗氧化劑溶液。氧消耗測量在水（25°C）中使用氧微傳感器（Micro-respiration System，Unisense，Aarhus，Denmark）進行，并以10秒為間隔記錄10分鐘。氧消耗數(shù)據(jù)按時間函數(shù)收集，線性區(qū)域曲線的斜率用于計算初始氧消耗率[V(O2)]。數(shù)據(jù)使用MicOX軟件（Unisense，Aarhus，Denmark）處理，并根據(jù)以下公式計算氧消耗指數(shù)（Ioxygen）：

Ioxygen = v(O2)sample / v(O2)blank

其中v(O?)sample是在水解產(chǎn)物存在下的初始耗氧量，v(O?)blank是用乙醇代替樣品處的初始耗氧量。樣品的耗氧量基于Trolox標準曲線（4, 2, 1 和 0 mmol/L）確定，其中指數(shù)作為Trolox濃度的線性函數(shù)，并表示為Trolox等效抗氧化能力。所有測量均重復兩次，結(jié)果報告為平均值。

鐵螯合能力的測定

基于 Wu 等人的方案，通過抑制Fe2?-Ferrozine復合物形成的能力來研究水解產(chǎn)物的鐵螯合能力。所有水解產(chǎn)物樣品通過0.45μm濾膜過濾，并用蒸餾水稀釋至5 mg/mL。取25μL樣品與100μL 75μmol/L FeSO?混合，孵育10分鐘后加入100μL 500μmol/L Ferrozine。使用酶標儀在562 nm處測量所得混合物的吸光度。Fe2?-Ferrozine復合物形成的抑制百分比通過以下公式計算：

鐵螯合抑制(%) = 100 - (100 × (Asample - Ablank) / Acontrol)

其中Asample是Fe2?-Ferrozine復合物與樣品混合的吸光度，Acontrol是Fe2?-Ferrozine復合物與水混合的吸光度，Ablank是樣品與Fe2?混合但Ferrozine被水替代時的吸光度。所有測量進行三次，結(jié)果報告為平均值。

ABTS自由基清除能力

根據(jù) Jensen 等人的方案并稍作修改，使用ABTS法測定水解產(chǎn)物的自由基清除能力。將ABTS自由基溶液用pH 7.4的10 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋，直至A405 nm達到0.7。所有樣品通過0.45μm濾膜過濾，并用蒸餾水稀釋至50μg/mL。隨后將50μL樣品與200μL ABTS自由基溶液混合，1小時后在405 nm處測量所得混合物的吸光度。清除能力通過以下公式計算：

自由基清除(%) = 100 - [100 × (Asample - Ablank) / Acontrol]

其中Asample是ABTS與樣品混合的吸光度，Acontrol是ABTS與水混合的吸光度，Ablank是樣品與水混合的吸光度。所有測量進行三次，結(jié)果報告為平均值。使用Trolox作為參考。