ABTS自由基清除能力


ABTS測定基于抗氧化劑將電子轉移或氫原子提供給預形成的ABTS自由基陽離子的能力，導致顏色變化和吸光度降低。如表2所示，在50μg/mL濃度下測試了水解產物的ABTS自由基清除能力。肺水解產物在ABTS清除方面最有效，但除心臟外，與其他水解產物無顯著差異。心臟顯示出最低的清除能力，并且與肺和結腸有顯著差異。活性值相似，自由基清除能力在87.9%到76.5%之間。這些值與羅非魚魚蛋白水解產物的自由基清除活性非常相似，并且高于對皮革肉渣水解產物和發酵蝦類生物廢物在50μg/mL濃度下測定的報道值，再次凸顯了豬組織作為抗氧化水解產物潛在底物的價值。


DPPH自由基清除能力


與ABTS類似，DPPH是一種自由基，當被抗氧化劑清除時，會改變顏色，導致吸收降低。表2展示了水解產物在5 mg/mL濃度下的自由基清除能力。與ABTS相反，心臟的水解產物顯示出最強的DPPH清除能力，其次是結腸、闌尾、胰腺和直腸。肝臟和肺顯示出最弱的DPPH清除能力。這些值與 Di Bernardini 等人報道的胰蛋白酶水解牛胸肌的值相似。然而，該研究使用的是1 mg/mL，而本研究使用的是5 mg/mL。總體而言，我們的DPPH自由基清除值低于其他研究。發現堿性蛋白酶水解的豬肝臟在3小時水解后表現出約40%的DPPH自由基清除能力。據報道，肌原纖維蛋白水解產物在24小時的 actinase E 或木瓜蛋白酶處理后，DPPH自由基清除能力分別約為65%和70%。然而，后一項研究沒有指定蛋白質濃度，因此難以進行比較。研究表明，水解產物濃度對皮革肉渣的DPPH自由基清除活性具有劑量依賴性效應，強調了報告清除能力濃度的重要性。然而，正如最近指出的，由于方法差異很大，導致即使使用眾所周知的標準品也會產生高度可變的值，因此比較實驗室之間的DPPH抗氧化能力是復雜的。因此，應謹慎進行比較，這也適用于其他方法，例如鐵螯合和ABTS自由基清除。


ABTS 與 DPPH


為了比較ABTS和DPPH自由基清除測定對我們特定樣品的適用性，采用了兩種方法。由于兩種測定都基于涉及有色促氧化劑還原的電子轉移機制，因此預期會產生相似的結果。另一方面，由于DPPH測定在有機溶劑體系中進行，因此更適合于親脂性化合物或高脂質含量的化合物，而ABTS測定則不是這樣，它與水和有機溶劑體系都兼容。其他研究比較了這兩種測定，據報道，與DPPH測定相比，ABTS測定檢測到的多種不同食品的抗氧化能力顯著更高，部分原因是高度著色的親水性抗氧化劑在ABTS測定中比在DPPH測定中反映得更好，這表明對于檢測一系列不同食品的抗氧化能力，ABTS測定可能優于DPPH測定。同樣，在這項特定的研究中，ABTS測定的值高于DPPH測定，顯示了前者更高的靈敏度，這與其他研究一致。然而，從高到低的自由基清除能力順序，兩種測定是相同的，除了肺和心臟樣品。有趣的是，ABTS測定將肺列為能力最高，心臟為最低，這與DPPH測定的結果完全相反。我們對此沒有很好的解釋。


組織與機制


在全部四種測定中測試時，沒有任何一種水解產物顯示出卓越的能力。相反，觀察到跨測定和水解產物的表現分布相對較廣。肝臟、結腸和闌尾在脂質氧化抑制方面顯示出最高值，并且在鐵螯合測定中分別排名第一、第二和第四。這表明了這些水解產物的抗氧化機制，即它們與用于引發氧化的氯化血紅素結合，從而削弱氧化。肝臟水解產物的高鐵螯合能力表明，它含有主要作為鐵螯合劑起作用的抗氧化肽，或含有更高濃度的可螯合鐵的血紅素色素。結腸和闌尾水解產物也顯示出高抗氧化能力的清除劑，表明這些水解產物含有可以作為清除劑操作的肽，此外還有作為鐵螯合劑的肽。我們假設大部分水解產物由肽組成，并且它們是抗氧化能力的原因，盡管水解產物可能含有內源性化合物，例如抗壞血酸，這些物質可能有助于整體抗氧化能力。然而，我們的目的是研究水解組織作為一個整體的抗氧化能力，即包括潛在的內源性抗氧化或氧化化合物。


表3顯示了每種測定中，水解產物從最高到最低能力的排序。不同組織表現出的不同抗氧化機制也指出了混合水解產物的優勢，因為它可以抑制更廣泛的氧化過程。

表3. 水解產物抗氧化能力從高到低的示意圖（排名）

脂質氧化抑制 鐵螯合 ABTS DPPH
最高抗氧化能力 結腸ab 肝臟a 肺a 心臟a
肝臟a 結腸b 結腸a 結腸b
闌尾a 胰腺b 闌尾ab 闌尾b
肺ac 闌尾b 胰腺ab 胰腺c
胰腺ac 直腸c 直腸ab 直腸d
心臟c 肺d 肝臟ab 肝臟e
最低抗氧化活性 直腸c 心臟e 心臟b 肺e

同一列中具有不同小寫字母的值在P<0.05水平上差異顯著。ABTS, 2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸; DPPH, 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼; TEAC, Trolox等效抗氧化能力。


1 脂質氧化抑制值是平均值，括號內為95%置信區間。


2 鐵螯合、ABTS 和 DPPH 自由基清除值是平均值±標準差。


3 在20μL水解產物（換算為100%干物質）下測試脂質氧化抑制。


4 在5 mg/mL濃度下測試鐵螯合和DPPH自由基清除，Trolox濃度為0.25 mmol/L。


5 在50μg/mL濃度下測試ABTS自由基清除，Trolox濃度為32μmol/L。


同一列中具有不同字母的水解產物在P<0.05水平上差異顯著。ABTS, 2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸; DPPH, 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼。


結論


所有組織在用 Alcalase 和 Protamex 水解后均顯示出抗氧化能力。來自結腸、肝臟和闌尾的水解產物在抑制脂質氧化方面特別有效，這可能歸因于它們的鐵螯合特性。此外，結腸和闌尾水解產物也顯示出高自由基清除能力，表明其具有廣泛的抗氧化潛力。我們的研究結果表明，動物副產品可以轉化為具有抗氧化活性的水解產物，從而可能創造附加值。這些水解產物在真實食品基質中作為抗氧化劑的適用性仍有待確定。