3. 結果與討論

3.1. SERS基底的表征

AgNPs通過檸檬酸鈉還原法制備，其等離子體共振帶位于450 nm（圖1B）。由于檸檬酸配體覆蓋了AgNPs的表面，它們帶負電荷。因此，我們采用層層組裝法，以帶正電荷的聚電解質（PDDA）為橋梁，將銀納米粒子固定在玻璃基底上。通過SEM（圖1C）表征了該SERS活性基底，結果顯示AgNPs均勻分散在玻璃基底上。AgNPs的平均直徑約為70 nm，形狀主要為球形，部分為棒狀。

SERS基底用4-MPY作為報告分子進行修飾。4-MPY的巰基末端與銀表面結合，而另一端吡啶的質子化改變了與4-MPY分子吡啶環相關的振動模式，從而實現傳感。我們首先記錄了4-MPY的光譜輪廓（圖1D）。測得的信號具有典型的4-MPY指紋特征，可以很好地識別。1091和1580 cm-1處的譜帶分別對應于環呼吸振動模式和C=C拉伸振動模式。在本研究中，采用這兩個峰的峰強度比進行pH傳感。眾所周知，SERS是一種散射效應，絕對信號強度會受到許多因素影響。例如，干燥過程會導致原始信號波動；然而，它對相對強度影響較小，因為相對SERS強度源于分子構型和質子化程度。因此，我們選擇比值測量方式，可以在定量分析中獲得更可靠的結果。

3.2. 響應時間優化

為了減少手術中因邊界檢測浪費的時間并降低麻醉風險，我們優化了SERS響應時間。響應酸性條件，4-MPY吡啶基團會發生質子化，如圖3A所示，這會導致SERS譜帶變化。SERS隨時間響應的反饋如圖S1所示。圖3B繪制了4-MPY兩個特征峰的比值變化（I1091/I1580）。可以看出，當連續采集光譜延長至10分鐘時，兩個特征峰的比值I1091/I1580開始保持不變，表明在本例中SERS檢測時間閾值為10分鐘。

3.3. 不同pH條件下4-MPY的測定

評估了SERS傳感芯片的pH響應特性。用傳感芯片測試了pH范圍為5.5-7.5的標準pH緩沖溶液。在每個不同pH下隨機采集8個點的SERS光譜。對獲得的原始光譜進行基線扣除處理。如圖3C所示，隨著pH值增加，1580 cm-1處的峰強度逐漸增加，而1091 cm-1處對應的峰強度逐漸減小，這可以通過4-MPY的N-質子化和去質子化來解釋。繪制了這些譜帶在不同pH條件下的比值，并用線性方程進行了擬合，擬合公式為y=-0.15x+2.35（圖3D）。因此，建立了I1091/I1580值與pH之間的關系，可作為測量組織樣品微酸性環境的校準曲線。

圖3. A) 吡啶分子結構在酸性和堿性條件下變化的示意圖。B) 不同響應時間下獲取的相同pH條件下4- MPY 兩個特征峰（I1093/I1584）的比值。C) 4- MPY 在不同pH緩沖液中響應的SERS光譜。D) 4- MPY 兩個特征峰（I1093/I1584）的比值及其pH值與線性擬合曲線。

3.4. 膠質瘤組織的pH響應

將上述SERS芯片用于膠質瘤組織間液的測量。首先，通過細胞懸液植入法將U87膠質瘤細胞懸液注射到胸腺切除小鼠的上肢腋下。培養14天后，獲得約1.0 cm3的膠質瘤。在局部麻醉下，將小鼠異位膠質瘤細胞完全剝離。為了收集小鼠膠質瘤細胞微環境的局部pH值，將4.0 μL水滴滴在小鼠膠質瘤細胞表面，以將組織間液提取到水滴中。10秒后，用移液器重新吸取，然后重新滴在SERS基底上進行SERS測量。收集小鼠膠質瘤的四個不同位置，并在每個位置測量10個SERS光譜。從結果中我們可以觀察到4-MPY具有很高的SERS活性，其信號在記錄的SERS譜圖中占主導。計算了I1091/I1580的比值，并獲得了相應的pH值（圖4）。可以看出，膠質瘤的局部微環境呈酸性。隨著測量位置接近腫瘤邊緣，腫瘤的pH值逐漸升高。因此，我們可以推斷該技術可用于確定腫瘤邊界。當微環境的局部pH處于生理范圍（7.35~7.45）內或大于此范圍時，證明腫瘤尚未侵入該區域，手術中可以保留該區域組織。

圖4. 在小鼠膠質瘤不同位置測量的特征峰比（I1091/I1580）及其對應的pH值。

還通過微電極測量了小鼠膠質瘤細胞局部組織間液的pH值。使用顯微操作平臺（圖5A）固定電極，操作標準電極尖端插入腫瘤。在測試真實組織之前，用四種不同的pH緩沖溶液校準微電極。獲得了標準微電極曲線，其公式為y=2.15x+77.87（圖5B）。通過4次平行試驗（圖5C）可以觀察到該裝置的重現性。將獲得的電位差代入上述公式計算，結果如圖5D所示。實驗數據表明，在同一位置，SERS技術測量的pH值與微電極直接獲得的結果具有良好的一致性，其差異僅在pH值的0.1-0.2范圍內，表明SERS測量pH是有效和準確的。

圖5. A) 微操作平臺系統。B) 微電極pH檢測方法的標準曲線。C) 使用微電極測量時，小鼠膠質瘤細胞不同位置對應的電位差。D) 通過PH微電極測量的小鼠膠質瘤不同位置pH值與SERS方法測量結果的對比。

4. 結論

通過開發一種比值SERS方法，建立了測量膠質瘤組織間液微酸性環境的實驗方法。通過對小鼠膠質瘤細胞的檢測，證明該方法合理且可重復。SERS報告分子可以響應局部pH值，從而區分腫瘤組織和正常組織，這已通過微電極系統得到證實。該技術也避免了其他需要將pH敏感探針注射入患者血液中的方法所帶來的風險和副作用。測試僅需幾秒鐘，適用于快速術中病理學檢查。憑借其簡便、快速和無創的優點，這種SERS策略可作為一種區分膠質瘤邊界的新手段。該技術使外科醫生能夠在可視化環境下盡可能多地切除腫瘤組織，同時保留更多功能性組織，這對于腦腫瘤患者具有重要意義，能夠提供更多機會并提高術后生存率和患者生活質量。