方法

富氫水和 DMEM 培養(yǎng)基的制備

富氫水是通過(guò)將 H2 在 0.4 MPa 壓力下溶解于水中飽和 6 小時(shí)，使用氫氣水裝置（由上海一泉投資有限合伙企業(yè)提供，中國(guó)上海）產(chǎn)生的，濃度為 1.0 ppm。該富氫水含有 400-1800 ppb 納米顆粒，以及在此適當(dāng)濃度下 -650 mV 的氧化電位，不易在水中蒸發(fā)或坍塌，因此可以比氫顆粒更穩(wěn)定地向細(xì)胞和組織供應(yīng)氫氣。富氫水每周新鮮制備一次，在常壓 4°C 下儲(chǔ)存在無(wú)死體積的鋁袋中，H2 濃度為 0.6 mmol/L。

接下來(lái)，我們特別配制了氫化 DMEM 培養(yǎng)基（H-CM），其中包含28毫升無(wú)菌氫化水（1.0 ppm）、8毫升5X DMEM 、4毫升10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素G以及100 μg/mL鏈霉素，該溶液中含0.7 ppm的雙原子氫（H2），并將其置于無(wú)菌離心管中。培養(yǎng)基每日新鮮配制，使用前需在4°C常壓條件下保存。對(duì)于PBS中溶解分子氫的濃度測(cè)定，我們采用氫氣電極（丹麥unisense公司）作為主要測(cè)量設(shè)備。將一根5微米含氫電極插入H-CM中進(jìn)行H2濃度測(cè)量。

細(xì)胞培養(yǎng)

Ishikawa 細(xì)胞系自 2017 年 10 月起在我院（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第一人民醫(yī)院）實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，目錄號(hào)：GCC-UT0004RT/CS。HEC1A 細(xì)胞系于 2016 年 1 月購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)：TCHu149。AN3CA 細(xì)胞系于 2016 年 3 月購(gòu)自 ATCC，目錄號(hào)：ATCC HTB-111。上述所有細(xì)胞系最近均檢測(cè)無(wú)支原體污染，并按照 ATCC 標(biāo)準(zhǔn)發(fā)展組織（SDO）2012 年 ANSI 標(biāo)準(zhǔn)（ASN-0002）和 Capes-Davis 的參考文獻(xiàn)中所述，使用短串聯(lián)重復(fù)（STR）分析進(jìn)行了鑒定，GENECHEM 遵循 ISO 9001:2008 和 ISO/IEC 17025:2005 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使用 GeneMapper 軟件 5 進(jìn)行 STR 分析。所有細(xì)胞系的使用均獲得了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第一人民醫(yī)院人類(lèi)研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。細(xì)胞在 DMEM:F12 中培養(yǎng) 24 或 48 小時(shí)：含有 10% FBS、100U/mL 青霉素 G 和 100μg/mL 鏈霉素，在 37°C、5% CO2 的濕潤(rùn)氣氛中培養(yǎng)。

分泌期子宮內(nèi)膜標(biāo)本取自 2018 年 10 月因異常子宮出血在我院行刮宮術(shù)的 3 例患者。對(duì)于原代人類(lèi)子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞培養(yǎng)，將 3 至 5 克子宮內(nèi)膜組織刮取并置于含有雙抗生素（青霉素 100 U/ml + 鏈霉素 100 U/ml）和甲硝唑的 DMEM:F12 無(wú)菌收集管中。然后用 D-Hank's 溶液、雙抗生素、100U/ml 甲硝唑洗滌組織 3 次，浸泡 5 分鐘后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，在超凈操作下去除紅細(xì)胞；接下來(lái)，將組織切成 2~3 mm3 小塊，用 0.1% 胰蛋白酶-EDTA 在 37°C 下消化 30 分鐘，每 10 分鐘搖動(dòng)一次；過(guò)濾溶液并加入 400 目（38 孔）篩網(wǎng)去除粘液、未消化的組織、上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。以 1000 rpm 離心 10 分鐘，棄去上清液。最后，將子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞重懸并培養(yǎng)于含有 10% FBS 的 DMEM:F12 中，置于 37°C、相對(duì)體積分?jǐn)?shù)為 5% CO2 的培養(yǎng)箱中使用。

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及原代人子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞系均與新鮮人臍帶血培養(yǎng)基（H-CM）共培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)，以確保細(xì)胞處于良好狀態(tài)。每次后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)前約20分鐘，再次更換新鮮H-CM以維持培養(yǎng)基中氫氣（H2）的持續(xù)濃度。每次功能實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)采用氫氣微電極測(cè)定培養(yǎng)基中的H2含量。

免疫組織化學(xué)染色

我們從 2018 年 5 月至 11 月在我院因子宮切除術(shù)或刮宮術(shù)獲得的子宮內(nèi)膜癌（n=16）、非典型增生（n=3）和良性分泌期子宮內(nèi)膜組織（n=6）中檢索樣本，我們的研究方法獲得了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海市第一人民醫(yī)院人類(lèi)研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。我們尊重人類(lèi)受試者的隱私權(quán)。研究中的所有參與者均確認(rèn)并簽署了關(guān)于個(gè)人可識(shí)別數(shù)據(jù)（包括生物醫(yī)學(xué)、臨床和生物特征數(shù)據(jù)）形式的同意書(shū)。實(shí)驗(yàn)符合赫爾辛基宣言。

處死小鼠后取出異種移植腫瘤組織。通過(guò)頸椎脫臼處死小鼠后，隨機(jī)檢查子宮內(nèi)膜標(biāo)本。對(duì)于免疫組織化學(xué)（IHC）分析，組織經(jīng)福爾馬林固定并石蠟包埋。煮沸后在檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中進(jìn)行抗原修復(fù)，與 0.01% Triton-X100 孵育 30 分鐘，與 5% 牛血清白蛋白孵育 20 分鐘。加入抗兔 NLRP3（1:200）、抗人 caspase-1（1:200）、抗人 GSDMD（1:100）或抗人 IL-1β（1:200）一抗，在潮濕室中 4°C 過(guò)夜，與生物素化二抗共孵育 50 分鐘。對(duì)于免疫組織化學(xué)的定量分析，使用顯微成像分析系統(tǒng)觀察和分析斑塊圖像。免疫組織化學(xué)染色根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例（0 分：0%，1 分：≤10%，2 分：11-50%，3 分：51-80%，4 分：≥80%）和染色強(qiáng)度（0 分：陰性，1 分：弱，2 分：中等，3 分：強(qiáng)）進(jìn)行評(píng)分，最終導(dǎo)致表達(dá)完全缺失，或弱、中、強(qiáng)表達(dá)。

蛋白質(zhì)印跡分析

使用 RIPA 緩沖液裂解和提取總蛋白。細(xì)胞蛋白在 SDS-聚丙烯酰胺微型凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，在 300 mA 下電泳 1.5 小時(shí)。使用的一抗包括抗兔 NLRP3（1:1000）、抗小鼠 ASC（1:1000）、抗人 caspase-1（1:1000）、抗人 GSDMD（1:1000）和抗人 IL-1β（1:1000）孵育 30 分鐘。用 5% BSA 封閉膜 1 小時(shí)，加入一抗在 4°C 過(guò)夜。二抗（1:5000）與膜在室溫下孵育 1 小時(shí)，隨后用 Tris 緩沖鹽水（TBST）洗滌三次。使用 ECL 化學(xué)發(fā)光和 Image 軟件進(jìn)行可視化和定量。

MTT 檢測(cè)

通過(guò) MTT 檢測(cè)分析細(xì)胞活力。轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)，將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞與 20μl 5mg/ml MTT（3-4,5-二甲基噻唑-2-基-2,5-二苯基溴化四唑）試劑在 96 孔板中于 37°C 孵育 4 小時(shí)，每孔約 2000 個(gè)細(xì)胞。從每個(gè)孔中移除培養(yǎng)基后，用 100μl 二甲基亞砜（DMSO）溶解孔中的甲臜顆粒，用分光光度計(jì)在 490 nm 處測(cè)量吸光度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次重復(fù)。

細(xì)胞內(nèi) ROS 水平的測(cè)量

通過(guò)二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）方法染色細(xì)胞測(cè)定總細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）。細(xì)胞與 10μM DCFH-DA 在 37°C 孵育 20 分鐘，與 100μL 細(xì)胞裂解液充分混合。每份 150μL 裂解物混合物在室溫下孵育 5 分鐘，并轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的 96 孔板中，使用熒光顯微鏡在 485 和 500 nm 激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)量。