線粒體 ROS 水平的測量

使用 MitoSOX Red 檢測方法測量線粒體 ROS。首先，將 50μg MitoSOX 超氧化物指示劑溶解在 5 mM MitoSOX 試劑儲備溶液中，與 10 uM MitoSOX 試劑在 37°C 孵育 10 分鐘。染色的細胞用 Tecan M100 復染并在溫緩沖液中進行熒光成像。

碘化丙啶（PI）染色

細胞在 12 孔板中培養，用冷 PBS 洗滌兩次，懸浮于 500μl 結合緩沖液中。加入 5 ng/mL 碘化丙啶（PI）以檢測細胞膜完整性，避光在室溫下孵育 15 分鐘。用 PI 染色細胞，并立即用流式細胞儀進行分析。使用 Olympus IX71 和 ImageJ 軟件捕獲和處理焦亡細胞的靜態明場照片。陽性細胞數/總細胞數 x 100% 代表 PI 陽性細胞比例，與未處理細胞的 PI 染色背景進行對比。

TUNEL 檢測

使用比色 TdT 介導的 dUTP 缺口末端標記（TUNEL）凋亡檢測試劑盒，按照制造商說明書標記核酸的末端，將從染色細胞中 DNA 的缺口鑒定為 TUNEL 陽性核。通過顯微鏡在每個視野的三個隨機選擇區域中計數每 100 個細胞中的 TUNEL 陽性細胞。

乳酸脫氫酶（LDH）釋放的測量

非刺激條件下的細胞內 LDH 總量比例被視為細胞外 LDH 活性。通過 LDH 細胞毒性檢測試劑盒測量細胞外乳酸脫氫酶（LDH），以檢測焦亡細胞死亡，按照制造商的說明進行。細胞以 6x10^3 個細胞/孔的密度在 H-CM 和 CM 中培養并孵育 12 小時，加入 1μg/mL 多西環素，收集上清液和細胞裂解物，在 48 小時后分析 LDH 釋放。

IL-1β 酶聯免疫吸附測定（ELISA）

使用人 IL-1β ELISA 檢測試劑盒分析 HEC1A、AN3CA 和 Ishikawa 細胞裂解物或培養基中的 IL-1β，按照制造商的說明進行。細胞在 24 孔板中培養過夜，使用 100 ng/mL 的 LPS 在 4°C 激活細胞 4 小時以刺激 NLRP3 炎癥小體，然后用 10μM 的尼日利亞菌素引發 2 小時。為了生成無細胞培養基以去除死亡細胞，我們收集細胞上清液，在 300g，4°C 離心 8 分鐘，濃縮上清液，在 12,000g，10kDa 截留，4°C 反復離心 30 分鐘。使用 R&D Systems 在 450 nm 處測量 IL-1β 水平。

GSDMD shRNA

我們設計了三個短發夾 RNA（shRNA）序列，并根據小干擾（siRNA）序列由上海 GeneChem 有限公司檢測了 shRNA 表達盒。將退火的寡核苷酸序列插入到消化的 GV493 載體的 Phu6 和 Pubi 位點之間以生成 shRNA 載體。使用 GV493 質粒（1.5x10^8 TU/mL 時 2μl，8 x10^8 TU/mL 時 3.75μL，6 x10^8 TU/mL 時 5μL）在 6 孔板中用 GV493 或 GSDMD 特異性 shRNA 顆粒（含 6mg/mL 的聚凝胺）感染 Ishikawa 細胞，加入 2 mg/mL 的嘌呤霉素以生成穩定克隆，與空載體進行比較。應用逆轉錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）確認 GSDMD 基因（NM_024736）的表達。

RT-qPCR

我們選擇了 GSDMD mRNA 引物并在不同濃度下進行了測試。使用 TRIzol 方法，通過 SYBR-Green 和熒光顯微鏡，使用逆轉錄試劑盒從子宮內膜癌細胞中提取總 RNA。通過熱循環將 GSDMD RNA 反轉錄為 cDNA：95℃ 變性，60℃ 退火 30 秒，然后在 72℃ 延伸引物模板 1 分鐘，共 40 個循環。使用 2-△△cq 方法計算相對基因表達水平。GSDMD siRNA 序列（正向引物，5‘- ACG GGC AGA GGT GGA GAC CAT-3’；反向引物，5‘-ATG GTC TCC ACC TCT GCC CGT-3’）的表達水平通過 GAPDH（正向引物，5‘- TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3’；反向引物，5‘- CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3’）的表達進行標準化。

體內腫瘤發生

4 周齡雌性 SPF 級 BALB/c 裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司下屬的上海靈暢生物科技有限公司（自 2019 年 3 月起），許可證號：SCXK（上海）2018-0003，用作人腫瘤異種移植模型；這些裸鼠是純合突變，無毛且胸腺缺陷，屬于 T 淋巴細胞功能障礙動物。方案獲得了上海交通大學醫學院附屬上海市第一人民醫院人類研究倫理委員會的批準，參考編號：2019SQ054。我們的研究符合赫爾辛基宣言以及動物護理和使用的機構指南。體重 18-25g 的 BALB/c 小鼠在右肩植入 1x10^7 個 AN3CA-LUC 細胞，在屏障環境下飼養，每只小鼠在獨立的通風籠中，溫度 22-26°C，濕度 45-65%，12/12 小時光/暗周期（燈光在 08:00 開啟）。墊料和飼料每 2-3 天更換一次。當腫瘤直徑長到 3 至 4 毫米并可見時，將小鼠隨機分為兩組：6 只小鼠為富氫水組，濃度為 1.0 ppm（HRW：H1, H2, H3, H4, H5, H6），3 只小鼠為純化水正常對照組（NC：P1, P2, P3）。小鼠分別通過灌胃給予富氫水或純水對照（20 mL/kg/d）。我們每天每 2 小時更換一次富氫水，治療持續 24 天。每 3-4 天測量并記錄小鼠體重和腫瘤體積。在實驗的第 12、13 和 14 天使用活體成像系統拍攝照片。

我們用過量的 2% 戊巴比妥鈉（0.5 mL）麻醉并處死動物，然后使用頸椎脫臼確認死亡。我們從不同組的小鼠中取出子宮內膜癌組織，并如前所述進行免疫組織化學以確定 NLRP3、caspase-1、GSDMD 和 IL-1β 蛋白的表達。所有樣本經組織學診斷為子宮內膜癌。

統計分析

使用卡方檢驗分析組間 IHC 的差異。使用 t 檢驗、多重 t 檢驗和通過 Tukey 事后檢驗進行多重比較的雙向方差分析評估 Western Blot、MTT 檢測、ROS、線粒體 ROS、PI、TUNEL、RT-PCR、LDH、ELISA、體內腫瘤發生中不同組間的模式差異。P < 0.05 被認為具有統計學顯著性。