材料

DMEM: F12（1:1，Gibco，美國），FBS：胎牛血清（Gibco，蓋瑟斯堡，馬里蘭州，美國），鏈霉素（Life Technologies，羅克維爾，馬里蘭州，美國），Triton-X100（Weiao，WF0193，上海，中國），抗兔 NLRP3（ab210491，Abcam，美國，1:200），抗人 caspase-1（2225，CST，美國，1:200），抗人 GSDMD（PA5-60727，ThermoFisher，美國，1:100），ECL 化學發光（Millipore）。ImageJ 軟件（美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州，美國）?？谷?IL-1β（12,242，CST，美國，1:200）。PVDF 膜（Millipore，比勒里卡，馬薩諸塞州，美國）?？剐∈?ASC（sc-514,414，SANTA CRUZ，美國，1:1000），BSA（Roche，曼海姆，德國），Tris 緩沖鹽水（TBST），二抗（DAKO，K5007，Proteintech，芝加哥，美國，1:5000 稀釋），二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，Beyotime，CA1410，江蘇，中國），MitoSOX? 試劑儲備溶液（iYEASEN，40778ES50，上海，中國），MTT（3-4,5-二甲基噻唑-2-基-2,5- 二苯基溴化四唑，Genview，美國）。

熒光顯微鏡（IX71，Olympus，日本）。TUNEL 凋亡檢測試劑盒（Beyotime，C1091，江蘇，中國），LDH 細胞毒性檢測試劑盒（Beyotime，C0016，江蘇，中國），IL-1β ELISA 試劑盒（CSB-E08053h，Cusabio，美國），GV493 載體（上海 GeneChem 有限公司），GSDMD 特異性 shRNA（上海 GeneChem 有限公司），聚凝胺（Genomeditech Co., Ltd.，上海，中國），嘌呤霉素（Clontech Laboratories，Mountainview，加利福尼亞州，美國），TRIzol（Thermo Fisher Scientific）方法，逆轉錄試劑盒（Promega Corporation，麥迪遜，威斯康星州，美國），SYBR-Green（DRR041B；Takara Biotechnology Co., Ltd.，大連，中國），氫氣微電極（丹麥Unisense）熒光顯微鏡（型號 IX71；Olympus Corporation，東京，日本），活體成像系統（Perkin Elmer，Lumina LT）。

結果

焦亡相關蛋白 NLRP3、caspase-1 和 GSDMD 在子宮內膜癌組織中過表達

在 TCGA 數據庫中檢測到 NLRP3、caspase-1 和 GSDMD 在子宮內膜癌組織（N=546）中相比正常子宮內膜（N=35）表達上調，在樣本類型和組織學類型中，NLRP3 和 GSDMD 存在顯著差異（P<0.05）。在子宮內膜癌中，與生存率相關的高表達組和低/中表達組之間，NLRP3、caspase-1 和 GSDMD 蛋白也存在差異趨勢，但不同研究機構之間存在不同的統計學差異?；谏鲜?TCGA 數據，為了為后續氫氣相關的機制性焦亡實驗奠定基礎，我們旨在探索焦亡現象是否存在于子宮內膜癌中。我們通過 IHC 對選自我院患者的子宮內膜組織切片進行 NLRP3、caspase-1、GSDMD 和 IL-1β 染色，以檢查它們在 1 級（8/15）、2 級（3/15）和 3 級（4/15）子宮內膜癌、非典型增生（n=3）和良性子宮內膜組織（n=6）中的表達。15 例中有 2 例（13.33%）表現為 NLRP3 染色陰性或弱陽性，而 86.67%（13/15）的腫瘤表現出更高的 NLRP3 染色。20%（3/15）的子宮內膜癌病例中觀察到 caspase-1 陰性或弱表達，80%（12/15）表現為中度至強表達，而所有良性子宮內膜標本均顯示 caspase-1 陰性或弱表達（n=6）。13.33%（2/15）的子宮內膜癌病例中觀察到 GSDMD 陰性或弱表達，86.67%（13/15）表現為中度至強表達。在 15 例子宮內膜標本中，73.33%（11/15）顯示 IL-1β 弱表達，20%（3/15）顯示 IL-1β 中度表達?？傮w而言，NLRP3、caspase-1、GSDMD 和 IL-1β 蛋白在癌癥和非典型增生組織中的表達高于良性子宮內膜組織，關鍵焦亡蛋白 caspase-1 和 GSDMD 存在顯著差異（P<0.05）。

表1：通過免疫組化檢測子宮內膜組織中 NLRP3、Caspase-1 和 GSDMD 的表達

	表達/病例	組別
		子宮內膜癌	非典型增生	良性子宮內膜
NLRP3	陰性/弱陽性	2	0	4
	中等陽性	3	2	1
	強陽性	10	2	1
Caspase-1	陰性/弱陽性	3	0	6
	中等陽性	5	0	0
	強陽性	7	2	0
GSDMD	陰性/弱陽性	2	1	4
	中等陽性	5	1	1
	強陽性	8	1	1
IL-1β	陰性/弱陽性	11	3	2
	中等陽性	2	1	2
	強陽性	1	1	2

圖2：通過免疫組織化學（IHC）在人子宮內膜組織中檢測焦亡相關蛋白 NLRP3、Caspase-1、GSDMD 和 IL-1β 的表達。（a-d）代表性 IHC 圖像顯示 NLRP3、Caspase-1、GSDMD 和 IL-1β 在良性子宮內膜、非典型增生和子宮內膜癌（I-III 級）組織中的表達。（原始放大倍數，×400；比例尺，20μm）。

這些觀察結果表明焦亡現象確實存在于子宮內膜癌中。然而，我們的臨床樣本量有限，需要進一步研究更多的樣本來得出臨床結論。此外，我們還在下面的實驗中通過 IHC 檢測了異種移植小鼠模型中腫瘤組織切片的焦亡蛋白表達。

NLRP3 炎癥小體和 GSDMD 在氫氣處理的子宮內膜癌細胞中過表達

我們觀察到 Ishikawa 和 HEC1A 子宮內膜癌細胞系中 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 和 GSDMD 的表達高于子宮內膜上皮細胞（圖 3a）。我們還研究了分子氫是否激活了焦亡相關蛋白。將富氫培養基（H-CM）添加到 Ishikawa、HEC1A 和 AN3CA 子宮內膜癌細胞系中，我們通過代表性蛋白質印跡分析檢測到，在 Ishikawa 和 HEC1A 細胞的相對密度直方圖上，H-CM 組和正常培養基（CM）組之間的 NLRP3、ASC、caspase-1 和 GSDMDNterm 存在顯著統計學差異（P<0.05）（圖 3a）。

當氫氣處理的細胞用 ROS 生成阻斷劑 N-乙酰半胱氨酸（NAC，5 mM）引發時，這些蛋白的表達下降，在 CM-、H-CM- 和 NAC 處理的 AN3CA 和 HEC1A 細胞的相對密度直方圖上，NLRP3、ASC、caspase-1 和 GSDMDNterm 顯示出顯著的統計學差異（P<0.05）（圖 3a-c）。在氫氣處理的子宮內膜癌細胞系中，pro-caspase-1 的表達有增加趨勢，但未觀察到顯著差異（P>0.05），我們認為這可能與氫氣對子宮內膜癌細胞系的作用時間有關，需要進一步研究。上述研究表明，分子氫對子宮內膜癌細胞中 NLRP3 炎癥小體和 GSDMD 的顯著激活作用可能存在關聯，這可能與 ROS 刺激有關。

圖3：氫氣激活子宮內膜癌細胞中的 NLRP3 炎癥小體和 GSDMD 蛋白表達。（a）通過蛋白質印跡分析檢測 Ishikawa 和 HEC1A 子宮內膜癌細胞系以及原代子宮內膜上皮細胞（EEC）中 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 和 GSDMD 的表達。GAPDH 用作上樣對照。（b， c）蛋白質印跡分析顯示，在 AN3CA 和 HEC1A 細胞中，經富氫培養基（H-CM）、正常培養基（CM）以及 H-CM 加 ROS 抑制劑 N-乙酰半胱氨酸（NAC）處理后，NLRP3、ASC、caspase-1 和 GSDMD-N 末端（GSDMDNterm）的表達。右側柱狀圖顯示了相對蛋白表達的量化分析（均值 ± 標準差，n=3）。*P < 0.05，與 CM 組比較；#P < 0.05，與 H-CM 組比較。