氫氣激活的 ROS 生成與子宮內膜癌細胞中 NLRP3 炎癥小體表達增加相關

為了分析氫氣處理子宮內膜癌細胞轉染后的細胞活力（24、48、72、96 和 120 小時），使用了 MTT 檢測。每個溶液在 490 nm 處用分光光度法測量。與 CM 培養的細胞相比，氫氣處理 AN3CA、HEC1A、Ishikawa 細胞在 48、72、96 和 120 小時以時間依賴性方式誘導細胞活力下降（P<0.05）（圖 4a）。

由于初始焦亡信號 ROS 和 NLRP3 炎癥小體是分子氫的潛在靶點，并且增加的腫瘤細胞 ROS 可以促進癌細胞死亡，因此我們研究了氫氣處理是否能夠促進子宮內膜癌細胞中 ROS 的積累。我們觀察到，使用 DCFH-DA 方法，與 CM 組相比，經 H-CM 處理的 Ishikawa、HEC1A 和 AN3CA 細胞在 20 分鐘后顯示出 ROS 生成顯著增加（P<0.05）。相比之下，NAC 降低了氫氣處理的子宮內膜癌細胞中的 ROS 水平（P<0.05）（圖 4b，c）。線粒體是產生 ROS 的主要細胞器，我們觀察到，與對照組相比，AN3CA、HEC1A 和 Ishikawa 細胞中通過 MitoSOX? Red 檢測方法測量的線粒體（mt）ROS 水平生成增加（P<0.05）（圖 4d）。因此，我們得出結論，分子氫激活了子宮內膜癌細胞中的 ROS 和 mtROS 生成。

接下來，我們使用有效的 NLRP3 抑制劑 MCC950 和 NLRP3 激活劑 LPS，評估了分子氫對 NLRP3 的激活作用是否源于其刺激 mtROS 的能力。用 NAC 和 MCC950 預處理降低了氫氣誘導的 Ishikawa 細胞中 mtROS 的產生（P<0.05），而 LPS 處理的細胞中 mtROS 水平上調（P<0.05）（圖 4e）。這些結果表明，在氫氣刺激下，NLRP3 炎癥小體的激活與其 mtROS 活性緊密相關。

圖4：氫氣處理誘導子宮內膜癌細胞中 ROS 生成并降低細胞活力。（a）MTT 法檢測 AN3CA、HEC1A 和 Ishikawa 細胞在正常培養基（CM）或富氫培養基（H-CM）中培養不同時間（24-120 小時）后的細胞活力。（b， c）使用 DCFH-DA 探針通過熒光顯微鏡檢測和量化 AN3CA、HEC1A 和 Ishikawa 細胞在指定處理后的總細胞內 ROS 水平。NAC 作為 ROS 抑制劑加入。（d）使用 MitoSOX Red 探針檢測和量化 AN3CA、HEC1A 和 Ishikawa 細胞中的線粒體 ROS（mtROS）水平。（e）在 Ishikawa 細胞中，使用 NAC（ROS 抑制劑）、MCC950（NLRP3 抑制劑）或 LPS（NLRP3 激活劑）與 H-CM 共同處理，評估 mtROS 水平。所有數據均為均值 ± 標準差（n=3）。*P < 0.05，與 CM 組比較；#P < 0.05，與 H-CM 組比較。

氫氣誘導的 ROS 和 NLRP3 炎癥小體介導的子宮內膜癌焦亡

為了鑒定氫氣處理的子宮內膜癌細胞中的焦亡細胞死亡，進行了 PI 和 TUNEL 染色，分別檢測細胞膜腫脹和 DNA 損傷。我們的結果顯示，與對照組相比，氫氣處理的 Ishikawa 細胞中 PI 陽性染色細胞增加且廣泛（P<0.05），在氫氣處理的 HEC1A 細胞中也觀察到類似結果（P<0.05）（圖 5a，b）。接下來，我們進行了 TUNEL 檢測以檢測焦亡級聯反應導致的 DNA 斷裂。如圖 5 所示，我們觀察到氫氣處理的 Ishikawa 和 HEC1A 細胞中 TUNEL 陽性細胞顯著多于 CM 組（P<0.05）。這些結果強烈表明氫氣激活了焦亡。在用 5mM NAC 處理 6 小時后，H-CM 處理的 Ishikawa 和 HEC1A 細胞中的 TUNEL 陽性細胞顯著下調（P<0.05）（圖 5c，d），表明 ROS 激活了焦亡。為了進一步表征氫氣刺激下 NLRP3 炎癥小體和 ROS 之間的關系，我們注意到，與 NAC 處理組相比，在 H-CM 中培養的 Ishikawa 和 HEC1A 細胞經 MCC950 和 LPS 處理后，6 小時內 TUNEL 陽性細胞的百分比分別下降和上升（P<0.05）。與 CM 組相比，MCC950 和 LPS 處理在 H-CM 中培養的 Ishikawa 細胞也導致 TUNEL 陽性細胞百分比顯著下降和上升（P<0.05），在 HEC1A 細胞中也觀察到類似趨勢，但未顯示顯著差異，這需要進一步研究（圖 5c，d，e）。這些結果暗示分子氫可能誘導子宮內膜癌中 ROS 和 NLRP3 炎癥小體介導的焦亡。

圖5：氫氣通過 ROS 和 NLRP3 炎癥小體誘導子宮內膜癌細胞焦亡。（a， b）代表性熒光圖像和定量分析顯示，經 H-CM 或 CM 處理的 Ishikawa 和 HEC1A 細胞中，碘化丙啶（PI）陽性細胞（紅色，指示膜完整性喪失）增多。（c， d）代表性圖像和定量分析顯示，經指定處理（H-CM、CM、NAC、MCC950、LPS）的 Ishikawa 和 HEC1A 細胞中，TUNEL 陽性細胞（綠色，指示 DNA 斷裂）增多。細胞核用 DAPI 復染（藍色）。比例尺，50μm。（e）不同處理組 Ishikawa 細胞中 TUNEL 陽性細胞的定量總結。所有數據均為均值 ± 標準差（n=3）。*P < 0.05，與 CM 組比較；#P < 0.05，與 H-CM 組比較。