GSDMD 作為焦亡必需組分的鑒定

在焦亡過程中，細胞膜上形成孔道，細胞內容物隨著死亡細胞染色而釋放。因此，接下來我們測量了乳酸脫氫酶（LDH）和 IL-1β 的釋放量，作為滲透性裂解的指標，這可以通過細胞死亡百分比和 OD450 值分別確定。我們研究了氫氣是否通過 ROS 和 NLRP3 炎癥小體決定焦亡細胞死亡，或者 GSDMDNterm 表達是否誘導了焦亡特征的終末裂解型細胞死亡。

我們通過使用攜帶 GSDMD shRNA 的慢病毒轉染 Ishikawa 細胞（包括三對 GSDMD 基因 shRNA 干擾片段（RNAi-1、RNAi-2 和 RNAi-3）以及一對陰性對照（NC））進行了 GSDMD 敲低實驗。蛋白質印跡分析顯示，與 NC 組相比，GSDMD 敲低的 Ishikawa 細胞中 GSDMDNterm 蛋白水平下調（圖 6b）。選擇轉染效率提高（78.8%）的 RNAi-1 用于后續實驗（圖 6a-c）。

與正常培養組相比，氫氣處理顯著增加了 HEC1A 和 AN3CA 細胞的細胞死亡百分比（圖 6d）和 OD450 值（圖 6g）。在 Ishikawa 細胞中，與 CM 組相比，氫氣處理刺激了顯著更高的 LDH 釋放（P<0.05）（圖 6e），并且 OD450 值甚至更高（P>0.05）（圖 6h）。這些結果驗證了分子氫在子宮內膜癌中誘導了焦亡。LPS 和尼日利亞菌素處理進一步上調了 LDH 和 IL-1β 的釋放（P<0.05），而在氫氣刺激下，NAC-、MCC950- 或 caspase-1 抑制劑 VX-765 處理的 HEC1A 和 Ishikawa 細胞中 LDH 釋放減少（P<0.05），證實了氫氣通過 ROS-NLRP3-caspase-1 途徑誘導焦亡（圖 6d，g）。

氫氣處理也上調了 GSDMD 敲低的 Ishikawa 細胞中的 LDH 釋放（圖 6e），但未能誘導 IL-1β 釋放（圖 6h）。當氫氣處理的 Ishikawa 細胞中 GSDMD 被敲低時，LPS 和尼日利亞菌素增強了 LDH 的釋放（P<0.05）（圖 6e），而 NAC 未能誘導 IL-1β 釋放（圖 6h）。GSDMD 敲低減少了 H-CM 和 CM 處理的 Ishikawa 細胞中 LDH 的釋放（圖 6f）和 IL-1β 的產生（圖 6i）（P<0.05）。我們在 LPS 和尼日利亞菌素或 NAC 處理的 Ishikawa 細胞中觀察到類似的結果，表明 GSDMD 敲低抑制了子宮內膜癌細胞中的焦亡細胞死亡（P<0.05）。然而，當 GSDMD 被沉默時，有或沒有氫氣處理的不同組 Ishikawa 細胞之間的 IL-1β 釋放沒有顯著差異（圖 6h）。因此，我們假設 GSDMD 是子宮內膜癌細胞中焦亡序列的終末蛋白，并且 GSDMD 介導的 IL-1β 分泌是通過 ROS-NLRP3-caspase-1 信號通路發生的，該通路由激活效應分子氫誘導。

圖6：GSDMD 是氫氣誘導的子宮內膜癌細胞焦亡所必需的。（a-c）在 Ishikawa 細胞中，通過慢病毒轉導 GSDMD 特異性 shRNA（RNAi-1， -2， -3）或陰性對照 shRNA（NC）敲低 GSDMD。（a）轉染效率的熒光圖像（綠色）。（b）敲低效率的蛋白質印跡驗證。（c）GSDMD mRNA 相對表達水平的 RT-qPCR 分析。（d-i）在不同子宮內膜癌細胞系（HEC1A， AN3CA， Ishikawa）及 GSDMD 敲低的 Ishikawa 細胞中，測量乳酸脫氫酶（LDH）釋放（細胞死亡指標）和 IL-1β 分泌（ELISA）以評估焦亡。細胞經指定處理：正常培養基（CM）、富氫培養基（H-CM）、LPS+尼日利亞菌素（Nig， 焦亡激活劑）、N-乙酰半胱氨酸（NAC， ROS 抑制劑）、MCC950（NLRP3 抑制劑）、VX-765（Caspase-1 抑制劑）。數據表示為均值 ± 標準差（n=3）。*P < 0.05，與 CM 組比較；#P < 0.05，與 H-CM 組比較；&P < 0.05，與 NC shRNA 組比較。

富氫水處理抑制體內子宮內膜腫瘤發生

接下來，我們旨在確定飲用富氫水是否會抑制子宮內膜癌小鼠模型中的腫瘤生長。九只 BALB/c 小鼠在右肩皮下植入 1x10^7 個 AN3CA-LUC 細胞，并每天自由飲用濃度為 1.0 ppm 的富氫水（HRW：H1, H2, H3, H4, H5, H6）或純化水正常對照（NC：P1, P2, P3）。腫瘤于 2019 年 3 月 31 日在 H1、H2、H3 和 P1、P2、P3 小鼠身上開始生長，而腫瘤于 2019 年 5 月 13 日在 H4、H5 和 H6 小鼠身上開始生長。出于倫理考慮，H1、H3 和 P2 小鼠在體積增加到 770.73-901.69 mm3 時于第 14 天處死，H4、H5 和 H6 小鼠在體積增加到 2317.83-4456.70 mm3 時于第 17 天處死，因此我們記錄了 H2、P1、P3 小鼠 24 天的數據，H1、H3、P2 小鼠 14 天的數據，以及 H4、H5、H6 小鼠 17 天的數據。

HRW 組小鼠在第 1 天體重為 18.1、19.2、20.1、17.0、21.3、17.9（克），NC 組小鼠體重為 19.4、22.2、21.1（克）。在整個實驗期間監測飲水量，各組之間幾乎相同。富氫水給藥減少了子宮內膜腫瘤的生長和腫瘤體積（mm3）（圖 7a）。與對照組相比，HRW 組小鼠的體重（克）在大部分觀察日（第 1-10、19-24 天）有所減輕（圖 7c）。HRW 組腫瘤體積增加的速度在第 7、14-19 天也逐漸下降。我們認為小鼠體重和腫瘤體積并未在所有觀察日持續下降的原因是個體差異。由于九只小鼠在第 1 天的絕對小鼠體重和腫瘤體積不同，為了平衡個體差異，我們認為觀察腫瘤體積的相對增加更有意義。因此，將第一天的腫瘤體積定義為 1，記錄增加或減少比例的持續時間作為相對腫瘤體積。我們觀察到，與對照組相比，HRW 組在所有觀察日（第 1-24 天）的相對腫瘤體積均下降（圖 7b）。這些觀察表明，氫氣在異種移植小鼠模型研究中具有抗腫瘤作用，但由于樣本量有限，需要擴大樣本量進行進一步研究。我們接下來證明，飲用富氫水降低了子宮內膜腫瘤在異種移植小鼠模型中的體積。我們給予富氫水（HRW）的小鼠在 12 天后顯示出放射性強度（ROI）降低，通過發光分析評估，表明腫瘤密度較低（圖 7d）。小鼠 H1、H3 和 P2 在第 13 天處死，而小鼠 H2 和 P1 在第 24 天處死。由于樣本量的限制，我們觀察到 HRW 組在第 12、13、24 天的總 ROI 呈下降趨勢（圖 7e）。因此，我們的研究表明，氫氣在子宮內膜癌中發揮抗腫瘤作用。接下來，我們進行了 IHC 染色，以探索氫氣誘導的抗腫瘤作用是否與焦亡相關。

圖7：飲用富氫水抑制異種移植小鼠模型中子宮內膜腫瘤的生長。（a）在整個實驗期間（24 天），富氫水（HRW）組和正常對照組（NC）小鼠的腫瘤體積（mm3）生長曲線。數據顯示為個別小鼠（細線）和組平均值（粗線）。(b) 相對腫瘤體積（以第 1 天體積為 1 進行標準化）的變化。(c) 小鼠體重（克）變化曲線。(d) 在實驗第 12、13 和 24 天，通過活體成像系統測得的代表性生物發光圖像（上排）和相應的腫瘤照片（下排），顯示 HRW 組（H2， H4， H5， H6）和 NC 組（P1， P3）小鼠的腫瘤發光強度（ROI）。(e) 第 12、13 和 24 天總發光通量（ROI）的定量分析。數據表示為均值 ± 標準差。*P < 0.05，與 NC 組比較。