摘要：通過跟蹤耗氧速率、電子自旋共振光譜檢測到的自由基形成以及抗氧化化合物亞硫酸鹽和硫醇的濃度，研究了啤酒儲存早期階段發(fā)生的自由基介導的反應。添加 Fe(III) 或 Fe(II) 具有相似的效果，表明啤酒中這兩種物質(zhì)之間可快速達到氧化還原平衡。鐵與過氧化氫的組合添加引起了最顯著的氧化水平，這是由于通過芬頓反應產(chǎn)生羥基自由基，直接引發(fā)了乙醇氧化。亞硫酸鹽濃度的下降幅度大于硫醇濃度，這表明硫醇作為抗氧化劑主要發(fā)揮次要作用，主要通過清除乙醇氧化過程中產(chǎn)生的中間體1-羥乙基自由基。升高溫度對耗氧速率的影響較小。

引言

啤酒的風味穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性密切相關(guān)，因為許多不良的異味是在儲存過程中通過氧化過程產(chǎn)生的。此外，負責新鮮風味特征和苦味的化合物，例如酒花衍生的異-α-酸，會因氧化而降解。特別是淡色啤酒通常具有細膩的香氣特征，很容易因氧化而改變，因為儲存過程中形成的老化味物質(zhì)具有非常低的風味閾值。在啤酒中，痕量的鐵和銅催化大氣中氧氣的初始活化以及隨后不同活性氧物種的形成，從而導致啤酒中的氧化損傷。過氧化氫，H2O2，是啤酒中形成的一種重要的活性氧物種，它可以與低價態(tài)的鐵和銅，F(xiàn)e(II) 和 Cu(I)，反應，通過芬頓反應（反應1）生成高反應活性的羥基自由基。

Fe2+ + H2O2 + H+ → Fe3+ + ?OH + H2O    (1)

?OH + CH3CH2OH → H2O + CH3?CH(OH)    (2)

CH3?CH(OH) + O2 → CH3CH(OH)OO? → CH3CHO + HOO?    (3)

羥基自由基以接近擴散控制的速率與大多數(shù)有機化合物反應，因此幾乎沒有選擇性。由于乙醇是啤酒中除水之外含量最豐富的成分，羥基自由基將優(yōu)先與乙醇反應生成1-羥乙基自由基（反應2）。進一步與氧氣反應導致形成1-羥乙基過氧自由基，其分解形成乙醛和氫過氧自由基（反應3）。當濃度足夠時，乙醛的形成會產(chǎn)生類似碰傷蘋果、雪利酒和/或堅果的異味，從而影響啤酒的風味。反應1-3中所示的自由基都能夠與啤酒中的其他成分（如蛋白質(zhì)、多酚和酒花衍生化合物）發(fā)生反應。這些副反應將導致渾濁的形成以及苦味的喪失，因此會對啤酒質(zhì)量產(chǎn)生直接的負面影響。因此，詳細了解啤酒復雜的氧化機制對于實現(xiàn)良好的氧化穩(wěn)定性和充分利用啤酒中潛在的內(nèi)源性抗氧化劑至關(guān)重要。

淡色啤酒通常含有亞硫酸鹽，它是由酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，并且是啤酒中一種有效的抗氧化劑，通過與 H2O2 發(fā)生非自由基反應來去除它，在 pH 4.2 條件下的二級反應速率常數(shù)約為 103 M-1 s-1。亞硫酸鹽作為啤酒中抗氧化劑的效率，即啤酒的氧化穩(wěn)定性，可以通過在 60°C 下強制老化并結(jié)合自旋捕獲和電子自旋共振光譜測定自由基的形成來評估。在淡色啤酒中，通常在初始滯后期后觀察到自由基的加速形成，并且該滯后期長度已被發(fā)現(xiàn)與亞硫酸鹽濃度相關(guān)。強制老化過程中檢測到的自由基是1-羥乙基自由基，這些自由基主要在 H2O2 與芬頓反應中的 Fe(II) 反應時形成，即當亞硫酸鹽耗盡后，繼之以乙醇與羥基自由基之間的反應（反應2）。含硫醇的蛋白質(zhì)也被認為通過在啤酒中催化去除 H2O2 而起到抗氧化劑的作用，但蛋白質(zhì)硫醇在啤酒中作為抗氧化劑的確切作用機制尚未闡明。硫醇濃度已被發(fā)現(xiàn)與ESR光譜測得的滯后期相關(guān)，并且含硫醇的啤酒蛋白脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白1已被證明具有高自由基清除能力。

本研究旨在主要通過跟蹤耗氧速率，研究啤酒中早期氧化過程階段的反應機制。氧氣是氧化反應中的核心反應物，因此消耗的氧氣量是氧化總程度的極好度量。然而，盡管該技術(shù)已成功用于葡萄酒氧化機制的機理研究，但迄今為止尚未用于啤酒氧化反應的機理研究。本研究的重點是表征對金屬催化氧化反應中自由基形成至關(guān)重要的化合物之間的相互作用。這包括通過ESR檢測中間自由基的研究，以及啤酒中亞硫酸鹽和硫醇的抗氧化特性的表征。

材料與方法

化學品。 ThioGlo 1熒光硫醇試劑購自Berry & Associates, Inc.。乙腈、谷胱甘肽、FeSO4·7H2O, H2O2、N-叔丁基-α-硝酮、1-辛醇、鹽酸和2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基購自Sigma-Aldrich。三羥甲基氨基甲烷、Fe2(SO4)3·H2O、三氟乙酸和抗壞血酸鈉購自Merck。亞硫酸鈉購自J.T. Baker。所有化學品均為分析純或最高純度。水通過Milli-Q純水系統(tǒng)純化。

從當?shù)爻匈徺I全麥比爾森啤酒，在 4°C 避光儲存。所有瓶子來自同一生產(chǎn)批次，重復分析使用不同的瓶子進行。實驗前，將 150 mL 啤酒在藍蓋瓶中攪拌 5 min 以脫氣。通過加入 15 μL 1-辛醇防止過度起泡。

啤酒的強制老化。 強制老化通過在升高溫度下孵育啤酒或添加芬頓試劑（單獨或組合添加不同濃度的 Fe(II) 或 Fe(III) 和 H2O2）進行。所有試劑每日新鮮配制。具體條件和濃度在每個圖的圖注中給出。