耗氧量測量

研究Fenton試劑添加效果的實驗采用150 mL雙頸圓底燒瓶進行，該燒瓶配備磁力攪拌棒并置于26°C水浴中。一個頸部用橡膠隔膜封閉，另一頸部安裝HQ 30d發光溶解氧（LDO）傳感器（德國杜塞爾多夫Hach Lange公司）。燒瓶內完全填充經2分鐘鼓泡新鮮飽和大氣空氣的脫氣啤酒。加樣后立即開始氧含量測量，每10秒記錄一次氧濃度，傳感器初始校準條件為26°C空氣飽和水。耗氧量通常在8小時內完成測量。實驗過程中通過橡膠隔膜使用注射器和針頭添加Fenton試劑溶液（Fe(II)、Fe(III)或過氧化氫）。溫度影響實驗采用Clark電極裝置（丹麥優尼森Unisense NR傳感器）。在預熱至目標溫度（26°C、40°C和60°C）的水浴中，用大氣空氣沖洗50 mL脫氣啤酒2分鐘使其飽和。隨后將樣品快速轉移至2 mL氣室（丹麥Unisense Mr-chamber公司），確保無空氣頂空。

鐵效應測試實驗中，加樣前立即加入20 μL 0.36 mM Fe溶液。填充后的腔室被置于恒溫水浴中，水溫與空氣飽和度實驗溫度相同，并配備了克拉克電極。測量立即開始。使用氧分析儀（Picoammeter PA 2000，Unisense，丹麥優尼森）每10秒記錄一次氧濃度。電極和氧分析儀通過兩點校準法進行校準，使用與實驗溫度相同的空氣飽和水和不含氧的0.1 M抗壞血酸鈉溶液（溶于0.1 M氫氧化鈉中）。每次分析前均進行校準。不同溫度下空氣飽和啤酒中氧的摩爾濃度根據舒卡列夫和托爾馬切娃報道的4、12、25及50°C下氧在醇-水溶液中的溶解度奧斯特瓦爾德系數計算得出。18 奧斯特瓦爾德系數(I)描述氣體在液體中的溶解度，其定義如公式1所示，其中VG為吸收氣體體積，VL為吸收液體體積：

I = VG / VL    (1)

表1. 與大氣空氣接觸時，水中和3.6%（質量分數）乙醇水溶液中的Ostwald系數和氧氣濃度^a

T (°C)	Ostwald系數		氧氣濃度 (μM)
	在水中	在 3.6%(w/w) 乙醇中	在水中	在 3.6%(w/w) 乙醇中
4	0.0451b	0.0468	416	432
12	0.0381b	0.0387	342	347
25	0.0310b	0.0322	266	277
26	0.0305	0.0314	261	268
40	0.0259	0.0264	212	215
50	0.0238b	0.0239	189	189
60	0.0223	0.0222	172	170
a 值根據Shchukarev和Tolmacheva報告的數據計算，如材料與方法部分所述。 b 數據來自Shchukarev和Tolmacheva。

Shchukarev和Tolmacheva報道的Ostwald系數是酒精質量百分濃度的函數。本研究中使用的啤酒密度為 1.01 g/mL，酒精含量相當于3.6質量 %。26 和 40°C 下水和3.6%乙醇水溶液中的Ostwald系數通過對Shchukarev和Tolmacheva數據的Van't Hoff圖進行二階多項式擬合插值得出，而 60°C 下水和3.6%乙醇水溶液中的系數則通過等效的二階多項式外推得出。Ostwald系數使用理想氣體定律公式2轉換為摩爾濃度。

n = (p · VG) / (R · T)    (2)

其中p是氣體的大氣壓，R是通用氣體常數，T是溫度。

根據氧氣濃度隨時間下降的情況，計算了 26°C, 40°C 和 60°C 下的耗氧速率常數，并根據Arrhenius公式3繪制圖表以確定溫度依賴性，其中k是速率常數，Ea 是活化能，A是指前因子，R是通用氣體常數，T是溫度：

ln k = ln A - (Ea/R) · (1/T)    (3)

Arrhenius圖的斜率 (Ea/R) 用于通過公式4計算溫度系數 (Q10)：

log Q10 = (10 · Ea) / (2.3 · R · T2)    (4)

其中 Q10 值表示溫度升高 10°C 時反應速率增加的倍數。

強制老化期間的ESR滯后期測量。 自由基形成的滯后期測量按照Uchida等人的方法通過ESR進行。啤酒通過磁力攪拌器攪拌5分鐘脫氣。將含有30 mM PBN的脫氣啤酒在 60°C 下于密閉藍蓋瓶中加熱，瓶內有大氣空氣頂空。在給定時間間隔取樣分析。ESR光譜在室溫下使用JES-FR30 ESR光譜儀記錄，使用石英毛細管樣品池。設置如下：微波功率，4 mW；掃描寬度，50.0 G；掃描時間，2 min；調制幅度1.25 G；時間常數0.3 s。ESR信號強度相對于附在ESR腔上的內部Mn(II)標準進行計算。所有ESR測量至少進行兩次重復。

亞硫酸鹽和硫醇分析。 亞硫酸鹽和硫醇的定量按照Abrahamsson等人和Hoff等人的方法進行，基于亞硫酸鹽和硫醇與ThioGlo 1熒光試劑衍生化，然后通過反相高效液相色譜分離和熒光檢測。亞硫酸鹽和硫醇測定至少進行兩次重復。

數據分析。 使用SAS 9.2軟件包進行統計分析。通過方差分析程序處理數據。使用平均值比較差異，并應用LSD比較平均值。顯著性水平為p<0.05。

結果

鐵和過氧化氫對耗氧的影響。 氧氣是各種氧化反應的核心反應物，因此耗氧速率預計可提供測試啤酒中氧化反應總體速率的定量信息。實驗在25至 60°C 的溫度下進行，使用脫氣啤酒，在氧氣測量開始前立即用大氣空氣快速飽和。啤酒中氧氣濃度在 26°C 下測量，在測量的最初10分鐘內，氧氣濃度迅速下降，隨后在接下來的8小時內呈較慢的線性下降（圖1）。實驗期間僅消耗了初始氧氣量的約25%。發現2小時后添加高濃度（36μM）的 Fe(II) 或 Fe(III) 對耗氧速率和程度有顯著影響。4小時后添加 H2O2 顯著增加了耗氧速率，并且與僅添加3.6μM Fe相比，預先添加36μM Fe后再添加 H2O2 導致的速率增加更大。令人驚訝的是，添加 Fe(II) 或 Fe(III) 的效果非常相似。這可能是由于啤酒中的還原性化合物能快速將 Fe(III) 轉化為 Fe(II)，與Kunz等人的發現一致。6小時后進一步添加 H2O2 不影響耗氧速率，這表明體系在第一次添加 H2O2 后已達到飽和。單獨添加 H2O2 并未導致耗氧速率比對照組顯著增加。這表明鐵和 H2O2 的組合比單獨化合物更能增加啤酒中的耗氧速率。

圖1. 添加芬頓試劑對 26°C 下貯藏啤酒耗氧的影響。在所示時間點，用針頭和注射器穿過橡膠隔墊添加試劑。曲線是典型實驗的代表，顯示了三次獨立實驗的平均值 ± 標準偏差。