在有和沒有添加3.6μM Fe(II) 的情況下，在 26°C、40°C 和 60°C 下測定空氣飽和的貯藏啤酒的耗氧速率，以確定氧化過程的溫度依賴性。發現耗氧量與時間呈線性關系，且隨著溫度升高，無論是否添加 Fe(II)，速率都略有增加。耗氧速率的Arrhenius圖呈線性相關，添加 Fe(II) 和不添加 Fe(II) 的活化能分別為26.6和22.4 kJ/mol（圖2）。溫度系數 Q10 描述了溫度升高 10°C 時反應速率增加的倍數，由公式4根據活化能計算得出。啤酒的 Q10 為1.4±0.1，添加了 Fe(II) 的啤酒為1.3±0.1。添加 Fe(II) 對耗氧的溫度依賴性沒有顯著影響。對于大多數生物反應，Q10 在2到3之間。因此，啤酒中耗氧的溫度依賴性較低，這可能是由于雙氧初始結合的反應焓較低。

圖2. 貯藏啤酒在 26°C、40°C 和 60°C 下有（實心方塊）和沒有（空心圓圈）添加3.6 μM Fe(II) 時的耗氧速率自然對數與絕對溫度倒數（1000×T-1）的Arrhenius圖。誤差線表示來自兩次獨立實驗的標準偏差。直線表示數據的線性回歸。

通過ESR光譜測定啤酒中自由基的形成。 通過測量ESR滯后期研究了耗氧對自由基形成的影響。啤酒在存在大氣空氣的情況下，在50或 60°C 下加熱不同時間。隨后，添加自旋捕獲劑PBN，并開始滯后期測量。發現啤酒在 50°C 下預熱長達120分鐘對滯后期長度沒有顯著影響（圖3）。將預熱溫度提高到 60°C 略微縮短了滯后期，預熱30分鐘后縮短更顯著，預熱60和120分鐘后效果更明顯。值得注意的是，新鮮啤酒的滯后期為110分鐘，而啤酒在沒有自旋捕獲劑PBN存在的情況下在 60°C 孵育120分鐘僅使滯后期縮短約30分鐘。這表明自旋捕獲劑在啤酒自由基生成機制中扮演著比僅僅捕獲自由基更主動的角色。預熱對滯后期長度的適度影響與耗氧量測量結果非常一致。顯然，即使啤酒在 60°C 大氣空氣存在下放置120分鐘后，仍含有活性抗氧化劑。向啤酒中添加3.6μM的 Fe(II) 或 Fe(III) 并在室溫下孵育15分鐘，使ESR滯后期縮短約30分鐘。用添加鐵的啤酒孵育更長時間并未進一步縮短滯后期。同樣，在這些實驗中，添加 Fe(II) 和 Fe(III) 對滯后期長度的影響相似。

圖3. 在 50°C（空心符號）和 60°C（實心符號）下預熱0、15、30、60和120分鐘對啤酒ESR滯后期的影響。誤差線表示兩次測量（n=2）的標準偏差，當大于符號時可見。不同字母表示在p<0.05水平上顯著不同。

在ESR滯后期測量前15分鐘組合添加 Fe(II) 和遞增濃度的 H2O2 產生兩種效果：（1）滯后期縮短，（2）同時捕獲自由基的初始水平增加（圖4A）。僅添加遞增濃度的 H2O2 只會縮短滯后期，不影響檢測到的自由基的初始水平。Uchida和Ono進行了類似的實驗，他們觀察到添加 H2O2 會導致滯后期完全消失，這很可能是由于他們使用了更高的 H2O2 濃度。據Uchida和Ono報告，H2O2 在 60°C 的啤酒中可積累高達15μM的濃度。發現滯后期隨 H2O2 濃度增加而線性縮短，而 Fe(II) 的添加降低了這種線性依賴的斜率（圖4B）。

圖4. （A） 在存在（實心符號）和不存在（空心符號）添加的3.6 μM Fe(II) 的情況下，添加遞增濃度的 H2O2 對ESR信號初始強度和滯后期的影響。誤差線表示來自至少兩個獨立實驗的標準偏差。（B） ESR滯后期對 H2O2 濃度的線性依賴，在存在（實心方塊）和不存在（空心圓圈）添加的3.6 μM Fe(II) 的情況下。誤差線表示來自至少兩個獨立實驗的標準偏差。

強制老化期間啤酒中亞硫酸鹽和硫醇的消耗。 已知亞硫酸鹽是啤酒中重要的抗氧化劑，亞硫酸鹽濃度常被發現與ESR滯后期相關。因此，也在強制老化過程中定量了啤酒中的亞硫酸鹽濃度。在 26°C 下用50μM H2O2 孵育啤酒15分鐘，導致亞硫酸鹽濃度下降約40μM，與是否添加3.6μM Fe(II) 無關（圖5）。這表明亞硫酸鹽在啤酒中主要與 H2O2 反應。增加 H2O2 濃度并未導致亞硫酸鹽進一步消耗（圖5）。在 26°C 下僅用3.6μM Fe(II) 孵育啤酒不影響亞硫酸鹽濃度。同樣，在沒有 H2O2 的情況下，添加36μM Fe(II) 或 Fe(III) 也不影響亞硫酸鹽濃度，這表明亞硫酸鹽本身不能在強制老化過程中保護啤酒免受氧化過程。

圖5. 在存在和不存在添加的3.6 μM Fe(II) 的情況下，添加遞增濃度的 H2O2 對 26°C 下孵育15分鐘后啤酒中亞硫酸鹽濃度的影響。誤差線表示來自至少兩個獨立實驗的標準偏差。

通過在 26°C 下孵育8小時和在 60°C 下孵育1和8小時進一步研究了亞硫酸鹽的消耗。發現亞硫酸鹽消耗高度依賴于溫度；在 26°C 下孵育8小時（不添加 Fe(II) 或 H2O2）導致損失約40%，而在 60°C 下孵育8小時則導致亞硫酸鹽完全耗盡（圖6A）。在 26°C 孵育時，添加36μM Fe(II) 不影響亞硫酸鹽濃度，而添加180μM H2O2 導致亞硫酸鹽幾乎完全耗盡，證明了 H2O2 和亞硫酸鹽之間的直接反應。組合添加3.6μM Fe(II) 和180μM H2O2 導致與不添加 Fe(II) 相似的亞硫酸鹽消耗。這一觀察結果再次證實了亞硫酸鹽在啤酒中去除 H2O2 的能力。令人驚訝的是，與添加3.6μM Fe(II) 相比，組合添加36μM Fe(II) 和180μM H2O2 導致了更高的最終亞硫酸鹽濃度。

圖6. （A）亞硫酸鹽和（B）硫醇濃度，啤酒在不同條件下孵育：（1）在 26°C 下8小時，無添加物；（2）在 26°C 下8小時，添加36 μM Fe(II)；（3）在 26°C 下1小時，添加180 μM H2O2；（4）在 26°C 下1小時，添加3.6 μM Fe(II) 和180 μM H2O2；（5）在 26°C 下1小時，添加36 μM Fe(II) 和180 μM H2O2；（6）在 60°C 下1小時，無添加物；（7）在 60°C 下8小時，無添加物。誤差線表示來自至少兩個獨立實驗的標準偏差。不同字母表示在p<0.05水平上顯著不同。

為了闡明蛋白質硫醇在啤酒中作為抗氧化劑的作用和反應機制，還在上述相同樣品中定量了硫醇。硫醇的消耗明顯不如亞硫酸鹽那樣依賴溫度，因為在 26°C 和 60°C 下的消耗模式非常相似（圖6B）。當啤酒在 60°C 下孵育8小時時，僅消耗了約50%的硫醇，而亞硫酸鹽已耗盡（圖6，A和B部分）。在無添加劑的啤酒中，所有孵育條件都導致硫醇損失，而添加 Fe(II) 和/或 H2O2 導致額外的硫醇損失。組合添加 Fe(II) 和 H2O2 導致最大的硫醇損失，表明硫醇主要與通過芬頓反應形成的1-羥乙基自由基反應?？紤]到觀察到添加36μM Fe(II) 和180μM H2O2 的啤酒中與添加3.6μM Fe(II) 和180μM H2O2 相比亞硫酸鹽得以保留（圖6A），可以排除硫醇保護亞硫酸鹽免于消耗的可能性，因為高濃度 Fe(II) 與 H2O2 組合添加并未導致額外的硫醇損失。