摘要： 鈷肟是流行的析氫分子催化劑，但迄今為止主要在非水條件下進(jìn)行研究。我們?cè)诖吮砻鳎鼈儗?duì)于設(shè)計(jì)用于中性水溶液的人工氫化酶也具有價(jià)值，并報(bào)告了通過(guò)將兩個(gè)鈷肟部分，{Co(dmgH)2} 和 {Co(dmgBF2)2}（dmgH2 = 二甲基乙二肟），結(jié)合到脫輔基抹香鯨肌紅蛋白（SwMb）上，制備兩種明確的生物雜交物種。所有光譜數(shù)據(jù)都證實(shí)鈷肟部分被插入到 SwMb 蛋白的結(jié)合口袋內(nèi)，并與鈷復(fù)合物的軸向位置上的一個(gè)組氨酸殘基配位，從而形成熱力學(xué)穩(wěn)定的復(fù)合物。量子化學(xué)/分子力學(xué)對(duì)接計(jì)算表明，與附近存在的另一個(gè)組氨酸殘基（His64）相比，對(duì) His93 有配位偏好。有趣的是，鈷中心的氧化還原活性在這兩種生物雜交物中都得以保留，這使它們具有在近中性水條件下析氫的催化活性。

引言

氫化酶催化質(zhì)子可逆還原為分子氫。它們?cè)跓崃W(xué)平衡下發(fā)揮作用，并顯示出非常高的轉(zhuǎn)換頻率，從而使它們作為獨(dú)特的有效分子催化劑在與鉑金屬競(jìng)爭(zhēng) H2/H+ 相互轉(zhuǎn)換方面具有競(jìng)爭(zhēng)力。由于它們的活性位點(diǎn)僅包含地球儲(chǔ)量豐富的第一行過(guò)渡金屬，例如鐵和鎳，在過(guò)去二十年中已經(jīng)報(bào)道了許多用于析氫的仿生和生物啟發(fā)合成催化劑。特別是，鈷肟和二亞胺-二肟鈷配合物已被證明是非水介質(zhì)中最活躍的析氫催化劑之一。

很少有研究探討這類(lèi)催化劑在完全水相條件下的活性。總的來(lái)說(shuō)，分子鈷基催化劑如鈷肟或二亞胺-二肟鈷配合物在 pH 7 時(shí)似乎不是很活躍，我們最近表明，它們?cè)?pH 7 的磷酸鹽水性緩沖液中周轉(zhuǎn)過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)化為鈷基納米顆粒。穩(wěn)定這些催化劑以用于中性水介質(zhì)的一種可能途徑是通過(guò)更好地控制活性中心的直接環(huán)境。最近，所謂的“人工酶”形式中的金屬蛋白帶來(lái)了靈感。事實(shí)上，在金屬酶中，多肽框架控制溶劑的接近性，并為活性位點(diǎn)提供低介電常數(shù)和極性的周?chē)h(huán)境，從而既調(diào)節(jié)其催化活性，又保護(hù)其免受不希望的分解反應(yīng)。人工酶，其中一個(gè)分子合成催化劑被嵌入一個(gè)精心選擇的肽或蛋白質(zhì)中，最近被證明在水中具有催化活性。有趣的是，[Co(dmgH)2(py)Cl]（dmgH2 = 二甲基乙二肟）與光系統(tǒng) I 的疏水自組裝產(chǎn)生了一種能夠光驅(qū)動(dòng) H2 生產(chǎn)的雜化復(fù)合物。

圖 1. 用于本研究的鈷肟配合物和抹香鯨肌紅蛋白（SwMb）的表示。蛋白質(zhì)的帶狀圖（PDB ID: 1UPD）顯示了血紅素結(jié)合口袋中的兩個(gè)組氨酸殘基（His64 和 His93）。

這些有希望的結(jié)果促使我們構(gòu)建基于鈷肟的人工氫化酶，即二氟硼烷橋連的鈷肟 [Co(dmgBF2)2(H2O)2]（1）和質(zhì)子橋連的鈷肟 [Co(dmgH)2(H2O)2]（2）。選擇抹香鯨肌紅蛋白（SwMb）作為宿主蛋白，因?yàn)樗軌蛲ㄟ^(guò)金屬離子在軸向位置上與位于其疏水腔中的適當(dāng)組氨酸殘基（His93）配位來(lái)結(jié)合幾種平面正方形配合物（包括其天然輔因子，血紅素）。我們?cè)诖藞?bào)告兩種能夠催化析氫的鈷肟-SwMb 生物雜交物 SwMb·1 和 SwMb-2 的制備以及生化和光譜表征。

實(shí)驗(yàn)部分

材料

血紅素、EuCl2、（乙二醇）雙（2-氨基乙基醚）-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）和 Nafion 溶液（5% 乙醇溶液）購(gòu)自 Sigma-Aldrich。[Co(dmgH)2(H2O)2] 和脫氮黃素（DAF）根據(jù)報(bào)道的程序制備。商業(yè)級(jí) C100 多壁碳納米管（MWCNTs；>95%）購(gòu)自 Nanocyl。S-（2,2,5,5-四甲基-2,5-二氫-1H-吡咯-3-基）甲基甲磺硫代酸鹽自 Reanal Private Ltd.（布達(dá)佩斯，匈牙利）購(gòu)買(mǎi)。

重組抹香鯨肌紅蛋白（SwMb）在大腸桿菌中的生產(chǎn)和純化根據(jù)報(bào)道的程序進(jìn)行，并作了一些修改。在該程序中，脫輔基-SwMb 通過(guò)將包涵體重溶于 0.1% 三氟乙酸水溶液中，然后依次對(duì) 20 mmol L-1 Tris-醋酸鹽（pH 5.0）和 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.5）溶液進(jìn)行兩次透析獲得（每一步通過(guò)離心去除沉淀的蛋白質(zhì)）。進(jìn)一步的純化通過(guò)使用用 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 8.0）和 20 mmol L-1 NaCl 緩沖液平衡的 Superdex 75 Hiload 16/60 Prepgrade 柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾（尺寸排阻色譜）。紫外-可見(jiàn)光監(jiān)測(cè)的滴定證實(shí)純化的蛋白質(zhì)完全用 1 當(dāng)量的血紅素重建。

物理測(cè)量

紫外-可見(jiàn)光譜使用 Shimadzu UV-1800 分光光度計(jì)在石英或塑料比色皿（1 cm 光程）中記錄。圓二色性（CD）測(cè)量使用 Jasco J-810 光譜儀進(jìn)行。電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）鈷滴定在格勒諾布爾大學(xué)醫(yī)院中心生物化學(xué)、毒理學(xué)和藥理學(xué)系進(jìn)行。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-AES）鈷滴定在阿貢國(guó)家實(shí)驗(yàn)室使用 Thermo Scientific iCAP 600 光譜儀進(jìn)行，誤差在 5% 以?xún)?nèi)。蛋白質(zhì)濃度通過(guò)玫瑰紅滴定法確定（使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)）。

連續(xù)波（CW）X 波段（9 GHz）電子順磁共振（EPR）實(shí)驗(yàn)使用兩臺(tái)不同的儀器獲得：（i）配備 Oxford ESR 910 低溫恒溫器的 Bruker EMX 光譜儀用于低溫研究（微波頻率用頻率計(jì)數(shù)器測(cè)量，磁場(chǎng)用 NMR 高斯計(jì)測(cè)量）；（ii）Bruker ELEXSYS E580 EPR 光譜儀（Bruker Biospin，萊茵斯特滕，德國(guó)），配備 TE102 矩形 EPR 共振腔（Bruker ER 4102st）和氦氣流低溫恒溫器（Air Product，阿倫敦，賓夕法尼亞州）。溫度由 Lakeshore 低溫溫度控制器（韋斯特維爾，俄亥俄州）控制，大約為 5 或 80 K。CW 實(shí)驗(yàn)中使用的場(chǎng)調(diào)制導(dǎo)致導(dǎo)數(shù)型線(xiàn)形。高頻 EPR 測(cè)量在阿貢國(guó)家實(shí)驗(yàn)室使用自制的 D 波段（130 GHz）光譜儀進(jìn)行，配備單模 TE011 圓柱形腔。樣品的高頻 EPR 光譜以脈沖模式記錄，以消除由于快速通過(guò)效應(yīng)引起的微波相位失真。通過(guò)監(jiān)測(cè)雙微波脈沖序列的電子自旋回波（ESE）強(qiáng)度隨磁場(chǎng)變化的函數(shù)來(lái)記錄 EPR 光譜的吸收線(xiàn)形。微波脈沖的持續(xù)時(shí)間分別為 50 和 70 ns，微波脈沖之間的典型間隔時(shí)間為 150-300 ns。

數(shù)據(jù)處理

使用 Xepr（Bruker BioSpin）和 Matlab 7.11.1（MathWorks）環(huán)境進(jìn)行。磁性參數(shù)從 EPR 光譜的理論模擬中獲得。模擬使用 EasySpin 軟件包（版本 4.0.0）進(jìn)行。確定多頻 EPR 光譜組的電子 g 張量的精度估計(jì)為 ±0.001（相對(duì)值）。請(qǐng)注意，取決于樣品位置磁場(chǎng)校準(zhǔn)的絕對(duì)誤差更大。

用于 EPR 測(cè)量的生物雜交物溶液在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）中制備，加入 100 mmol L-1 NaCl 和 10% 甘油，并在手套箱中引入 4-mm 外徑石英管中。自旋定量通過(guò)比較在非飽和條件下記錄的光譜的積分強(qiáng)度與在非飽和條件下記錄的 MTSL 自旋標(biāo)記溶液的光譜的積分強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行。