Co K 吸收邊（7.709 keV）X 射線吸收近邊結構（XANES）和擴展 X 射線吸收精細結構（EXAFS）光譜在阿貢國家實驗室先進光子源的 12BM 光束線收集。單色儀中使用 Si（111）雙晶。使用鍍鉑鏡聚焦光束并去除高次諧波 X 射線光子。樣品處的光束尺寸約為 0.4 mm（垂直）x 1 mm（水平）。使用反饋系統控制單色儀晶體角度，并設置為 70% 失諧。使用 13 元素鍺固態檢測器（Canberra）收集鐵 X 射線熒光信號。在檢測器前放置鐵過濾器以衰減彈性散射，這將樣品的熒光與彈性散射的信號比從 <1:100 增加到 ~1:1。檢測器放大器的輸出連接到單通道分析器（SCA）陣列，其上下閾值設置僅允許 Ka1 和 Ka2 熒光信號進一步處理。在樣品前放置電離室用于入射 X 射線通量參考信號 I0，第二和第三個電離室放置在樣品后。插入第二和第三個電離室之間的鈷箔用于能量校準。SCA 的輸出信號連接到標量陣列，該陣列與托管數據采集程序的計算機（G. Jennings，阿貢國家實驗室）接口。在 20 K 下進行 X 射線吸收光譜測量時，使用 Tris-HCl 緩沖液和甘油（10%）的混合物防止冰晶形成。配合物 1 在乙腈溶液中測量，樣品溶液在 20 K 的低溫恒溫器（Janis 型號 CCS-150）內研究。

所有電化學測量均在室溫下在氮氣氣氛下進行。使用標準的三電極配置，包括基于 CNT 的工作電極（見下文）、輔助鉑絲和 Ag/AgCl/飽和 AgCl 水溶液 + 3 mol L-1 KCl（在本文中表示為 Ag/AgCl）參比電極，由 Vycor 熔塊封閉并直接浸入溶液中。然后使用 [Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4- 電對（E0 = 0.215 V vs Ag/AgCl 或 0.425 V vs SHE，在 pH 7 磷酸鹽緩沖液中）用于水溶液中的測量標準化。Fc+/Fc 電對（E0 = 0.45 V vs Ag/AgCl）在電解質溶液為 0.1 mol L-1 nBu4NBF4/CH3CN 時用作參比。循環伏安圖使用 Biologic SP300 恒電位儀記錄。H2 釋放使用連接到 Unisense 氫氣微電極，用 100%、40% 和 10% H2 飽和的去離子水校準。輻照使用 300 W 氙燈（Oriel，無臭氧）在 280 W 下運行，并耦合充滿水的 Spectra-Physics 6123NS 液體過濾器以消除紅外輻射，對于使用釕基光敏劑的實驗，使用 Spectra-Physics 59472 紫外截止濾光片（λ > 400 nm）。

理論計算。 孤立鈷配合物的計算采用量子化學（QC）密度泛函理論（DFT）方法，使用 B3LYP 泛函和三 ζ 基組 def2-TZVP。所有電子結構計算均使用 ORCA 程序包進行。所有幾何優化均使用適用于乙腈的隱式溶劑模型 COSMO 方法進行。

對接計算使用分子力學（MM）和混合 QC/MM 勢能的混合物，使用 pDynamo 建模程序進行。蛋白質的起始結構取自蛋白質數據庫（SwMb PDB 代碼 1UPD），去除所有非蛋白質基團，并使用 ProPKA 為適當的殘基分配質子化狀態。鈷配合物的結構從先前進行的 DFT 計算中獲得。對接的初始結構通過將鈷配合物放置在蛋白質輔基空出的位點中獲得，Co-NHis 距離為 2.5 ?。然后使用幾何優化和分子動力學模擬的混合物，結合 OPLS-AA MM 力場，對這些初始結構進行能量最小化。模擬中，配合物 5 ? 內的所有殘基原子可以自由移動，而距離超過 5 ? 的蛋白質殘基原子則被諧波約束在其原始位置。Co-NHis 距離被諧波約束在 2.5 ?。優化在配合物繞 Co-NHis 軸每 10° 增量進行，所得結構根據其能量排序。對水在鈷遠端配位的情況（Co-O 水距離諧波約束在 1.9 ?）進行了類似的計算。然后使用半經驗 PM6 方法和上述相同的 OPLS-AA 力場對最低能量 MM 優化結構進行 QC/MM 計算。QC 區域包含鈷配合物、配位組氨酸的側鏈（CH2 咪唑基團），以及如果存在，水。使用此勢能的優化以與 MM 優化相同的方式進行，但沒有鈷與配位組氨酸和水基團之間的諧波約束，因為這些相互作用現在在 QC 理論水平上處理。

生物雜交物 SwMb·1 的制備。 生物雜交物在手套箱中在濕的氮氣氛下于 18°C 制備。將 1 的溶液（500 μL, 1 mmol L-1）在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）中緩慢加入 SwMb 的溶液（500 μL, 1.7 mg mL-1 或 0.1 mmol L-1）中。將黃色溶液在 4°C 下攪拌 1 小時，轉移到 NAP10 脫鹽柱，并用相同緩沖液洗脫。收集黃色蛋白質級分（1 mL, 0.76 mg mL-1 或 0.45 mmol L-1；產率 90%）并在整個研究過程中保持在惰性氣氛下，除非另有說明。

生物雜交物 SwMb·2 的制備。 生物雜交物在手套箱中在濕的氮氣氛下于 18°C 制備。將 2 的溶液（500 μL, 1 mmol L-1）在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）中緩慢加入 SwMb 的溶液（500 μL, 3.6 mg mL-1 或 0.2 mmol L-1）中。將黃色溶液在 4°C 下攪拌 1 小時，轉移到 NAP10 脫鹽柱，并用相同緩沖液洗脫。收集黃色蛋白質級分（1 mL, 1.2 mg mL-1 或 0.7 mmol L-1；產率 66%）并在整個研究過程中保持在惰性氣氛下，除非另有說明。

修飾的 CNT 電極的制備。 將 MWCNTs（29 mg）在無水乙醇（210 mL）中的懸浮液通過超聲均勻化。連續將 10 μL 等分試樣沉積到 Teflon 包埋的玻碳電極（5 mm 外徑）上，直到電活性表面完全覆蓋。電極在空氣中干燥，然后將一滴（15 μL）蛋白質溶液沉積到 MWCNTs 的表面上。在空氣中干燥后，最終加入 Nafion 溶液（15 μL）。

使用銪（II）鹽的催化測定。 制備在手套箱中在濕的氮氣氛下于 18°C 進行。從等體積的 EuCl2 和 EGTA 儲備溶液（400 mmol L-1）制備 [Eu(EGTA)(H2O)]2-（200 mmol L-1）在 1 mol L-1 Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液中的溶液。生物雜交物（SwMb·1 或 SwMb·2）溶液由 SwMb 溶液（通常 100 μL, 0.1 mmol L-1）在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中和 1 或 2 的溶液（10 μL, 0.8 mmol L-1）在去離子水中原位制備；特意略微不足化學計量地引入 1 或 2 以確保與蛋白質完全結合。將該溶液轉移到 Unisense 400 μL 微型呼吸室中，從手套箱中取出，并將氫氣微電極浸入溶液中。一旦信號穩定 10 分鐘，通過 Hamilton 注射器加入銪（II）溶液。

光催化測定。 制備在手套箱中在濕的氮氣氛下于 18°C 進行。[Ru(bipy)3]Cl2（10 mmol L-1）和 DAF（1.4 mmol L-1; E400 nm = 12000 mol-1 L cm-1）的溶液在去離子水中制備。生物雜交物（SwMb·1 或 SwMb·2）溶液由 SwMb 溶液（通常 100 μL, 0.1 mmol L-1）在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中和 1 或 2 的溶液（10 μL, 0.8 mmol L-1）在去離子水中原位制備；特意略微不足化學計量地引入 1 或 2 以確保與蛋白質完全結合。

在基于 [Ru(bipy)3]Cl2 作為光敏劑的實驗中，用補充了 NaCl（150 mmol L-1）和抗壞血酸鈉（100 mmol L-1）的 50 mmol L-1 磷酸鉀（pH 6）緩沖液稀釋生物雜交物溶液。然后將溶液轉移到 Unisense 400 μL 微型呼吸室中，從手套箱中取出，并將氫氣微電極浸入溶液中。一旦信號穩定 10 分鐘，通過 Hamilton 注射器加入 [Ru(bipy)3]Cl2 溶液（相對于鈷催化劑 20 當量），并開始照射。

在基于 DAF 作為光敏劑的實驗中，用 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液稀釋生物雜交物溶液。然后將溶液轉移到 Unisense 400 μL 微型呼吸室中，從手套箱中取出，并將氫氣微電極浸入溶液中。一旦信號穩定 10 分鐘，通過 Hamilton 注射器加入 DAF 溶液（相對于鈷催化劑 0.5 當量），并開始照射。