結果

生物雜交物的制備和生化表征

脫輔基-SwMb [10-100 μmol L-1 在 Tris-HCl 緩沖液（pH 7.0）中] 與 5-10 摩爾當量的鈷肟 1 和 2 反應分別產生生物雜交物 SwMb-1 和 SwMb·2。使用尺寸排阻色譜去除過量的鈷肟。鈷的定量分析（ICP-MS 或 ICP-AES）和蛋白質（玫瑰紅法）表明每個多肽鏈存在一個鈷配合物。通過 3 kDa 截留分子量的膜濃縮是有限的，因為它通常導致鈷配合物的損失（在制備最終蛋白質濃度為 1 和 2 mmol L-1 的溶液時分別損失約 30% 和 60%）。校準的尺寸排阻凝膠色譜證實了生物雜交物的單體性質，它們與脫輔基和全 SwMb 蛋白質共同洗脫。

紫外-可見光譜

圖 2. （a）SwMb·1（黑色）、脫輔基-SwMb（藍色）和配合物 1（紅色）在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中的紫外-可見光譜。（b）SwMb·1 在 300 到 600 nm 范圍內的光譜細節。所有光譜在相同條件下記錄，蛋白質濃度為 0.1 mmol L-1，1 的濃度為 0.1 mmol L-1。

SwMb·1 和 SwMb·2 溶液的紫外-可見光譜顯示在支持信息中的圖 2 ，與相同濃度的脫輔基-SwMb 和配合物 1 和 2 的光譜一起。SwMb·1 的光譜顯示其兩個組分的光譜特征：（i）蛋白質特征的 280 nm 區域的譜帶；（ii）1 的光譜中存在的 260 nm 譜帶；（iii）350 到 450 nm 之間的寬而平的吸收帶，與配合物 1 的兩個吸收特征（327 nm, ε = 1.7 x 103 mol-L cm-1, 和 455 nm, ε = 3 x 103 mol-L cm-1）相關，這些特征是由于鈷（II）中心的 d-d 躍遷。該譜帶的藍移和增寬不僅是由多肽環境引起的，也由 His93 的配位引起，因為組氨酸配體是比水更強的配體。當 1 用濃度遞增的咪唑處理時，這些譜帶受到類似的影響。相比之下，SwMb-2 的紫外-可見光譜缺乏預期的鈷（II）中心的特定吸收帶。相反，除了蛋白質在 280 nm 的吸收帶外，在 300-400 nm 區域觀察到一個重要的肩峰。這個肩峰讓人想起鈷（III）鈷肟如 [Co(gH)2pyCl]（gH2 = 乙二肟）的吸收。

我們研究了在 SwMb·1 和 SwMb·2 中用血紅素替換 1 和 2 的可能性，這是 Watanabe 及其同事先前用于評估 SwMb 腔內是否存在席夫堿配合物的策略。當脫輔基-SwMb（10 μmol L-1）在室溫下用 1 當量的血紅素處理時，全 SwMb 在幾分鐘內形成。相反，在相同條件下，沒有血紅素可以摻入 SwMb·1 或 SwMb·2 中，如紫外-可見光譜所示（圖 3 ）。這一觀察進一步支持了鈷肟占據血紅素結合位點的假設。

圖 3. 在 25°C 下，將 1 當量血紅素加入到（a）SwMb·1 和（b）SwMb·2（兩者均為 10 μmol L-1，在 50 mmol L-1 Tris-HCl pH 7.0 中）后的紫外-可見光譜的時間進程。每 2 分鐘記錄一次光譜。插圖：在 408 nm 處吸光度隨時間的變化。

圓二色性

圖 4. SwMb·2（黑色）、全 SwMb（紅色）和脫輔基-SwMb（藍色）在 190 到 260 nm 范圍內的圓二色性光譜。樣品在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中，濃度為 0.1 mmol L-1。

圖 4 比較了 SwMb·2 在紫外區域的 CD 光譜與脫輔基和全 SwMb 的光譜。用 SwMb·1 獲得了類似的數據。所有光譜在 205 和 225 nm 處都顯示出與 α-螺旋存在相關的特征。全 SwMb 光譜中 190-200 nm 區域的信號（在脫輔基-SwMb 光譜中不存在）被歸因于通過 His93 配位引起的圍繞血紅素的特定局部蛋白質折疊。在兩種生物雜交物的光譜中都觀察到了相同的信號，進一步支持了鈷配合物在生物雜交物中被 His93 配位的假設。

電子順磁共振光譜

圖 5. （a）SwMb·1 在 50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中的連續波 X 波段 EPR 光譜（黑色）及其模擬（紅色）。（b）SwMb·1 在相同緩沖液中的脈沖 D 波段 EPR 光譜（黑色）及其模擬（紅色）。（c）配合物 1 在甲醇中的連續波 X 波段 EPR 光譜（藍色）作為比較。所有光譜在 80 K 下記錄。SwMb·1 的模擬參數在表 1 中給出。

圖 5 所示的 SwMb·1 溶液的 EPR 光譜是低自旋（S = 1/2）鈷（II）在鈷肟中的典型光譜。可以使用光譜的高場部分進行基本分析。與 59Co 核（I = 7/2; 100% 自然豐度）的超精細耦合導致 gz 分量分裂成八個信號，其中六個在高場區域很容易區分。每個信號都顯示出三線圖案（1.4 mT 分裂），表明單個氮原子（I = 1; >99% 自然豐度）的軸向配位，可能來自組氨酸殘基。先前對這種和密切相關鈷肟在各種溶劑中的廣泛 EPR 研究表明，沒有軸向氮原子或具有兩個軸向配位氮原子的鈷肟看起來完全不同。

例如，圖 5 顯示了 1 在甲醇中的光譜，其中沒有發生氮的軸向配位。水溶液（表1）中未結合的鈷肟給出的 EPR 光譜與在甲醇中獲得的光譜非常相似。

表 1. 包括 SwMb·1 在內的不同環境中 {Co(dmgBF2)2} 部分的 EPR 模擬參數a

溶劑/配體/蛋白質	g_{x}	g_{y}	g_{z}	|A|(59Co) [MHz]	|A|(14N) [MHz]
SwMb·1	2.3365	2.1835	2.0010	80, 10, 292b	30, 30, 39b
1 在甘油/H2O 混合物中	2.2750	2.1785	2.0065	15, 15, 329b	不適用
1 在甲醇中	2.2840	2.1820	2.0080	53, 20, 338b	不適用
1 + 1 當量吡啶在甲醇中	2.2380	2.1530	2.0058	10, 10, 285b	33, 36, 43
1 + 1 當量 p-PDIc 在甲苯中	2.3473	2.1815	2.0000	85, 10, 306b	30, 30, 40b

自旋定量確定鈷（II）低自旋鈷肟的摩爾分數僅占樣品中鈷濃度的約 36%。相比之下，1 在甲醇中的樣品的自旋定量與 100% 金屬含量為低自旋鈷（II）一致。寬場掃描在 X 波段進行，但未檢測到高自旋鈷（II）或其他順磁性鈷物種的跡象。脈沖 D 波段 EPR 光譜顯示樣品中至少存在另一種次要的順磁性物種，具有相對較寬的線形，盡管這個/這些次要物種的身份尚不清楚。自旋定量和鈷滴定之間差異的最可能原因是相當一部分鈷物種是抗磁性的，很可能是鈷（III）氧化態，這與下面討論的 XANES 數據一致。發現 SwMb·2 生物雜交物的樣品是 EPR 靜默的，這可能反映了鈷（III）鈷肟單元的存在，與其電子吸收光譜一致。在 X 和 D 波段記錄的 EPR 光譜已經過模擬，磁性參數，包括主 g 值和 59Co 及 14N 超精細值，在表 1 中給出。