摘要

脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞位于腦室中，產(chǎn)生大部分腦脊液。通過(guò)確定電致性 Na+-HCO3- 協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NBCe2 對(duì)腦脊液 pH 調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)，驗(yàn)證了正常大腦功能是通過(guò)脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞介導(dǎo)的酸-堿當(dāng)量排出以調(diào)節(jié)腦脊液 pH 來(lái)維持的假說(shuō)。我們生成并驗(yàn)證了一種新的 NBCe2 基因敲除小鼠品系。與對(duì)照小鼠相比，NBCe2 敲除小鼠脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)堿化后的堿排出率降低了 77%。在高碳酸血癥誘導(dǎo)的酸中毒期間，NBCe2 敲除小鼠和脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞靶向性 NBCe2 siRNA 敲低小鼠的腦脊液 pH 恢復(fù)分別減少了約 85% 和 90%。NBCe2 敲除不影響基線呼吸頻率或潮氣量，且 NBCe2 敲除和野生型小鼠對(duì)暴露于 5% CO2 表現(xiàn)出相似的呼吸反應(yīng)。NBCe2 敲除小鼠在藥理或加熱誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作發(fā)展中未受到保護(hù)。總之，我們通過(guò)證明 NBCe2 對(duì)于高碳酸血癥誘導(dǎo)的酸中毒后適當(dāng)?shù)哪X脊液 pH 恢復(fù)是必要的，從而確立了脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞參與腦脊液 pH 調(diào)節(jié)的概念。

引言

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的正常神經(jīng)元功能依賴(lài)于穩(wěn)定且合適的內(nèi)部物理化學(xué)環(huán)境，其中細(xì)胞間隙 pH 是決定神經(jīng)元興奮性的重要參數(shù)之一。大腦 pH 值的紊亂會(huì)由于支配細(xì)胞電學(xué)特性的膜蛋白質(zhì)子化狀態(tài)的改變而影響神經(jīng)元功能，因此嚴(yán)重的酸中毒會(huì)導(dǎo)致意識(shí)模糊、昏迷并最終死亡，而大腦堿中毒則會(huì)導(dǎo)致驚厥，例如熱性驚厥。糾正酸堿紊亂的主要調(diào)節(jié)系統(tǒng)是肺通氣（控制 PCO2）和腎臟對(duì)酸-堿當(dāng)量的排泄（即凈 NH4+、H+ 或 HCO3- 分泌）的變化。通氣反應(yīng)主要依賴(lài)于感知大腦間質(zhì)液中 PCO2 和 H+ 的中樞化學(xué)感受器。

血-腦屏障和血-腦脊液屏障對(duì) CO2 具有高滲透性，但對(duì) H+ 和 HCO3- 的滲透性則低得多。因此，動(dòng)脈 PCO2 的增加能被中樞化學(xué)感受器快速感知，從而能夠?qū)Ω咛妓嵫Y做出快速的呼吸反應(yīng)。然而，許多經(jīng)典研究也表明，在代謝性酸-堿紊亂期間血液 pH 的急性變化會(huì)傳遞到腦脊液。因此，盡管腦脊液 PCO2 快速跟隨血漿 PCO2，但跨血-腦屏障和血-腦脊液屏障的上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)使得腦脊液內(nèi)的 [HCO3-] 能夠抵消 PCO2 的變化，從而即使在血漿 [HCO3-] 沒(méi)有變化的情況下也能恢復(fù)腦脊液 pH 值。在狗身上，Kazemi 及其同事表明，盡管血漿 pH 值較低，但在吸入 10% CO2 后 6 小時(shí)內(nèi)腦脊液 pH 值恢復(fù)正常，這表明腦脊液盡管其蛋白質(zhì)緩沖物含量低，但通過(guò)去除酸或輸入堿當(dāng)量（如 HCO3- 進(jìn)入腦脊液）可以有效防止酸-堿紊亂。脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞被認(rèn)為介導(dǎo)了 H+ 和 HCO3- 從血液到腦脊液的轉(zhuǎn)運(yùn)，以響應(yīng)酸-堿紊亂。它通過(guò)將 HCO3- 從血液轉(zhuǎn)運(yùn)到腦脊液或通過(guò)從頭合成 HCO3- 以排出到腦脊液來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。血-腦脊液屏障（即脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞）主動(dòng)將 HCO3- 擠出到腦脊液中，最早由 Maren 提出作為呼吸性酸中毒的補(bǔ)償機(jī)制。盡管有明確跡象表明脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞在腦脊液 pH 調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，但這種現(xiàn)象背后的分子機(jī)制仍不清楚。

脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞位于四個(gè)腦室中的每一個(gè)，這個(gè)非常活躍的上皮單層是腦室內(nèi)腦脊液的主要來(lái)源。脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞含有許多參與電解質(zhì)和水分泌的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并表達(dá)多種其他參與酸-堿當(dāng)量跨質(zhì)膜運(yùn)動(dòng)的蛋白質(zhì)。在管腔（面向腦脊液）質(zhì)膜中表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，電致性 Na+-HCO3- 協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NBCe2 是已知的唯一堿排出蛋白。已知 NBCe2 以 1:3 的化學(xué)計(jì)量比將 Na+ 和 HCO3- 從上皮細(xì)胞輸出到腦脊液。NBCe2 的定位和轉(zhuǎn)運(yùn)方向使其成為大腦酸中毒期間維持腦脊液 pH 值的明顯候選者。在基底外側(cè)膜，Na+ 依賴(lài)性 Cl-/HCO3- 交換蛋白 Ncbe 從血液側(cè)輸入 Na+ 和 HCO3-。陰離子交換蛋白 AE2 也在基底外側(cè)膜表達(dá)，負(fù)責(zé)從細(xì)胞中排出 HCO3-。電中性 Na+-HCO3- 協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NBCn1 也在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中表達(dá)，但該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的膜定位在物種間有所不同。它將 Na+ 與 HCO3- 一起轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。在管腔膜中，Na+/H+ 交換蛋白 NHE1 將 H+ 從細(xì)胞中排出以交換 Na+。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)腦脊液 pH 調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)仍有待量化。

先前有兩項(xiàng)研究調(diào)查了小鼠中基因刪除 NBCe2 的后果。在 Kao 等人的研究中，通過(guò)插入靶向上游的外顯子 15 的基因陷阱載體實(shí)現(xiàn)了 Slc4a5 缺失。在 Groger 等人的研究中，通過(guò)插入靶向外顯子 7 的 loxP 位點(diǎn)刪除了 Slc4a5。在這兩種情況下，移碼突變和隨后的最終 NBCe2 蛋白截?cái)鄬?dǎo)致了 NBCe2 的缺失。Slc4a5 缺失導(dǎo)致的結(jié)果在這兩種模型之間存在差異。在 Kao 等人的研究中，免疫組織化學(xué)分析顯示電中性 Na+-HCO3- 協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Ncbe 的表達(dá)被打亂。該蛋白通常只在基底外側(cè)膜表達(dá)，但在 NBCe2 敲除中，Ncbe 在兩個(gè)膜中都有表達(dá)。此外，還觀察到 Na+,K+-ATP 酶亞基表達(dá)的顯著變化：在 NBCe2 敲除小鼠的脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn) a1 亞基存在于基底外側(cè)膜以及管腔膜中。β2 亞基在 NBCe2 敲除的脈絡(luò)叢上皮中缺失。

在敲除小鼠中，觀察到管腔 Na+-K+-2Cl- 協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NKCC1 和細(xì)胞骨架蛋白 spectrin βII 在細(xì)胞內(nèi)和管腔都有表達(dá)。這些蛋白質(zhì)大多參與脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞分泌腦脊液，并且確實(shí)在該研究中腦室容積和顱內(nèi)壓顯著降低。電解質(zhì)分析顯示，NBCe2 敲除小鼠的腦脊液 [HCO3-] 降低，表明腦脊液的酸-堿調(diào)節(jié)存在缺陷。注射驚厥劑戊四氮顯示，NBCe2 敲除小鼠對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作敏感性較低。與這些發(fā)現(xiàn)相反，Groger 等人未檢測(cè)到腦室容積的差異，表明該小鼠模型的 NBCe2 敲除表型不太嚴(yán)重。該研究未調(diào)查脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分布和腦脊液的電解質(zhì)組成。然而，腦室表型的差異表明兩種敲除模型之間存在顯著差異，這可能歸因于基因靶向策略的差異。兩種技術(shù)都導(dǎo)致了經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的移碼和所得蛋白質(zhì)的截?cái)唷；蛳葳宀迦雽?dǎo)致表達(dá)相對(duì)較大的非功能性 NBCe2 蛋白，包括可能干擾其他脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞蛋白表達(dá)的第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。外顯子 7 缺失方法可能存在表達(dá)選擇性剪接的 NBCe2 形式的風(fēng)險(xiǎn)，但 NBCe2 敲除的質(zhì)譜分析似乎排除了這種可能性。在不知道差異的確切原因以及哪種敲除模型最可能反映 NBCe2 功能的情況下，似乎有必要建立一種新的 NBCe2 缺失小鼠模型，以避免截短和剪接變體的可能性。

在本研究中，我們生成了一個(gè)靶向 NBCe2 保守的第一個(gè)跨膜片段的敲除模型。這防止了信號(hào)肽介導(dǎo)的向粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)移。截短蛋白插入膜的過(guò)程受到阻礙，這一點(diǎn)通過(guò)使用針對(duì) NBCe2 N 末端的新型抗體得到了驗(yàn)證。我們假設(shè)，脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中通過(guò) NBCe2 的 HCO3- 轉(zhuǎn)運(yùn)是面對(duì)急性呼吸性酸中毒時(shí)調(diào)節(jié)腦脊液 pH 的主要分子機(jī)制。我們利用通過(guò) Cre-Lox 系統(tǒng)生成的新型 NBCe2 敲除小鼠，以及靶向的 siRNA NBCe2 敲低方法，來(lái)研究 NBCe2 在調(diào)節(jié)和維持脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞和腦脊液 pH 中的作用。我們表明，敲除 NBCe2 可降低脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)堿化后恢復(fù)期間的堿排出率。

在 NBCe2 敲除和 NBCe2 敲低小鼠體內(nèi)進(jìn)行的腦脊液 pH 腦室內(nèi)記錄表明，NBCe2 對(duì)于維持腦脊液 pH 從高碳酸血癥誘導(dǎo)的酸化中恢復(fù)是必要的。因此，我們建議通過(guò) NBCe2 排出 HCO3- 作為對(duì)脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞局部補(bǔ)償性調(diào)節(jié)腦脊液 pH 的第一個(gè)機(jī)制性見(jiàn)解。了解參與腦脊液堿化及其調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，可能在臨床需要藥物方法調(diào)整腦脊液 pH 的情況下（例如在癲癇發(fā)作或酸堿紊亂期間）證明是有益的。