通過活細胞成像記錄細胞內pH值


將分離的脈絡叢組織用4μgml-1分散酶和4μgml-1膠原酶B在無鈣的HEPES緩沖液中37°C消化30分鐘，消化成單層細胞團。將消化后的細胞團塊接種在包被了Cell-Tak的蓋玻片上10-15分鐘，并用pH敏感探針BCECF-AM或羧基-SNARF負載10分鐘。將蓋玻片安裝在封閉的灌流小室中，并置于37°C暗箱內的倒置顯微鏡載物臺上。允許細胞在HEPES緩沖液中平衡至基線pH水平，然后按圖和圖例中詳述的方案執行。


對于使用BCECF的pHi記錄，在配備尼康PlanApoVC60x/1.40NA油浸物鏡的尼康Eclipse顯微鏡載物臺上對細胞進行成像。使用TillVision軟件控制單色器波長在490nm和440nm之間交替，控制曝光時間、頻率和像素合并。在510-535nm的發射光由12位冷卻單色CCD相機記錄，并在背景減除后從用戶定義的單個細胞感興趣區域收集數據。樣本量n指來自一只小鼠至少三個獨立脈絡叢上皮細胞的平均值。在單獨的實驗中，通過在含10μM尼日利亞菌素的高K+HEPES緩沖液中逐步將pHi從8鉗制到6，將激發熒光比率校準到pH。每個實驗都以在pH7.0、含10μM尼日利亞菌素的高K+HEPES緩沖液中進行單點校準結束。


對于使用SNARF的pHi記錄，使用iMic顯微鏡和OlympusUApoN340,40x/1.35NA油浸物鏡對細胞進行成像。使用TillVision軟件控制單色器激發波長在485nm和555nm之間交替，控制曝光時間、頻率和像素合并。在565-615nm的發射光由14位冷卻單色EMCCD相機記錄，并在背景減除后從用戶定義的單個細胞感興趣區域收集數據。通過在含10μM尼日利亞菌素的高K+HEPES緩沖液中逐步將pHi從8.4鉗制到7，將激發熒光比率校準到pH。每個實驗以在pH7.5、含10μM尼日利亞菌素的高K+HEPES緩沖液中進行單點校準結束。


在峰值或谷值pHi后的30秒內測定pHi恢復速率。凈酸或堿流出量計算為總緩沖容量和dpHi/dt的乘積。總緩沖容量計算為固有緩沖容量和CO2/HCO3-緩沖系統貢獻的總和。如前所述，通過記錄在逐步降低NH4+濃度期間的pHi變化來確定固有緩沖容量。


氣壓測量


使用氣壓法測量對5%CO2的通氣反應。將清醒、不受約束的小鼠單獨放置在封閉的恒溫室內，并使其適應過夜。以約300mlmin-1的流速將室內空氣泵入室內。將流出氣流連接到氣體分析系統，測量O2和CO2的分數濃度。濕度傳感器測量室內的相對濕度，差壓傳感器測量通氣驅動的壓力。約16小時后，關閉小室，在基線條件下測量通氣頻率和潮氣量5分鐘。然后沖洗小室15分鐘并再次關閉。現在將CO2注入小室至最終濃度為5%，并重復記錄通氣頻率和潮氣量。體積相關的壓力信號由BIOPACMP100數據采集系統以200Hz的采樣率收集。通過用校準的玻璃注射器注入和抽出已知體積來進行體積校準。在每個實驗結束時，使用直腸熱電偶測量體溫。將通氣壓力軌跡導出到Mathematica，然后在腳本中進行分析，該腳本檢測所有峰值并計算其幅度和頻率。從這些分析中，可以根據Drorbaugh和Fenn給出的方程式計算每只動物的潮氣量。


血氣分析


從異氟烷麻醉的小鼠右心耳抽取混合動靜脈血樣，使用肝素化PICO注射器，并在血氣分析儀上分析血氣。


腦室Slc4a5敲低小鼠的生成


使用氯胺酮和甲苯噻嗪的腹腔注射麻醉野生型C57BL/6小鼠。當充分麻醉后，將小鼠固定在立體定位儀上，并將含有靶向RLuc或小鼠Slc4a5的內切核糖核酸酶制備的siRNA庫的微升Hamilton注射器放置在側腦室。通過注射FastGreen染料確定針放置的最佳立體定位坐標。讓腦組織圍繞針密封3分鐘，之后以0.5μlmin-1的速率將10μl濃度為200ngμl-1的siRNA遞送到腦室系統中。注射后，將針留在腦內5分鐘以防止腦脊液和siRNA回流。取出針后，縫合切口，讓小鼠在加熱燈下恢復。皮下注射劑量的丁丙諾啡用于鎮痛。


圖1：用于生成NBCe2條件性敲除小鼠的靶向策略示意圖。A，示意圖描繪了用于生成具有“floxed”NBCe2基因的小鼠的靶向策略。

Slc4a5野生型基因組序列和外顯子11到15在示意圖上標出。顯示了用于生成靶向構建體以及用于篩選胚胎干細胞克隆的Southern印跡探針、PCR引物和載體限制性酶切位點的位置。B，在通過FLP重組去除neo盒后，floxed基因的類似表示，以及在Cre重組后外顯子13缺失基因的類似表示。C，示意圖顯示了基因分型中使用的PCR引物的退火位點，以及野生型、floxed和缺失等位基因基因分型的預期產物大小。

在NBCe2敲除、敲低和野生型小鼠中進行體內腦脊液pH測量


通過在側腦室放置pH電極在麻醉小鼠上進行體內腦脊液pH測量。測試了兩種類型的pH電極：首先，使用在pH4、7和10緩沖液中校準的玻璃微電極，并將其放置在右側腦室。然后在頭骨左側鉆一個小孔，并慢慢降低參比電極直到接觸到腦組織。每3秒測量一次pH信號，并用傳感器記錄軟件進行分析。其次，使用連接在pH微發射器上的針型光學pH微傳感器，在22°C下通過多點校準或在37°C下通過單點校準進行校準。將微傳感器插入右側腦室，每2秒測量一次pH值。使用連接到pH發射器的直腸溫度探頭來補償溫度依賴性pH變化。在概念驗證實驗中，通過將10μlHamilton注射器與pH電極平行放置在左側腦室來測試兩個電極。在確定基線pH值后，注入1μl5mMHCl，并連續監測pH變化5分鐘。在兩個電極之間，化學光學pH微傳感器被證明更適合我們的目的，并在后續實驗中使用。


在pH電極穩定后的5分鐘內測定基線腦脊液pH值。在高碳酸血癥實驗中，通過連接到立體定位儀的鼻部給予含有5%CO2的正常空氣氣體混合物。讓小鼠吸入5%CO2氣體混合物30分鐘，然后切換回吸入正常室內空氣。在整個實驗期間，通過給予小劑量的上述氯胺酮/甲苯噻嗪混合物來保持小鼠麻醉。在隨后的分析中，比較了CO2暴露最后20分鐘期間的腦脊液pH值。計算基于每分鐘平均pH值。在NBCe2敲除和野生型小鼠以及NBCe2敲低小鼠上進行測量，其中在注射siRNA后24和48小時測定基線pH值，而在注射siRNA后48小時測量恢復情況。所有小鼠在實驗后被處死。