定量PCR

快速分離脈絡(luò)叢并放入RNAlater穩(wěn)定溶液中。使用GeneJetRNA純化試劑盒純化總RNA。使用NanoDropND-2000通過260nm處的吸光度測定純化RNA的濃度。然后使用iScript逆轉(zhuǎn)錄Supermix對80-120ngRNA進行逆轉(zhuǎn)錄。使用StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)、商業(yè)化的TaqMan基因表達檢測和通用TaqMan基因表達MasterMix進行qPCR擴增。PCR循環(huán)條件為50°C2分鐘，95°C10分鐘，隨后進行40個循環(huán)：95°C15秒和60°C1分鐘。結(jié)果顯示為相對于對照物（注射RLucsiRNA的小鼠）的相對NBCe2表達倍數(shù)變化。

通過戊四氮給藥或高熱誘導(dǎo)癲癇發(fā)作

對于藥理性誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，小鼠吸入異氟烷麻醉2分鐘，并腹腔注射45mgkg-1的戊四氮。然后將小鼠放入單獨的籠子中，并通過視頻記錄監(jiān)測60分鐘。癲癇發(fā)作活動分析與Kao等人相似。簡而言之，癲癇發(fā)作分類如下：0期，無反應(yīng)；1期，面部抽搐；2期，肌陣攣性抽搐，無直立姿勢；3期，肌陣攣性抽搐和伴有雙側(cè)前肢陣攣的直立姿勢；4期，陣攣-強直性發(fā)作；5期，全身性陣攣-強直性發(fā)作伴姿勢控制喪失。當達到5期或60分鐘后，處死所有小鼠。

通過將加熱燈放置在透明圓柱形容器上方并將容器內(nèi)空氣加熱至42°C來誘導(dǎo)高熱性癲癇發(fā)作，方法類似于Christensen等人。將小鼠放入容器中引起過度通氣，從而降低PCO2。測定從將小鼠放入加熱容器到發(fā)生癲癇發(fā)作的時間。小鼠在容器中停留的最長時間為10分鐘。實驗結(jié)束后處死小鼠。

統(tǒng)計分析

通過Student非配對雙尾t檢驗比較NBCe2敲除或敲低小鼠與野生型，分析活細胞成像、血氣、癲癇發(fā)作數(shù)據(jù)和腦脊液pH測量結(jié)果。通過雙因素方差分析比較兩個獨立變量：基因型和處理，分析氣壓測量數(shù)據(jù)。方差分析后進行Sidak多重比較檢驗。P值<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過非配對雙尾t檢驗分析qPCR數(shù)據(jù)，誤差線表示RQmin和RQmax值。

結(jié)果

完全NBCe2敲除小鼠的生成和驗證

完整NBCe2基因敲除小鼠的構(gòu)建與驗證

過程中的基因分型實例如圖2A所示。上圖展示了通過野生型/flx雄鼠與他莫昔芬處理的野生型/flx雌鼠雜交后，鑒定出的WT/flx小鼠及WT/KO（即HZ小鼠）后代。下圖呈現(xiàn)雜合子繁殖的基因分型結(jié)果，該方法可獲得NBCe2野生型、敲除型及HZ小鼠。在832只活產(chǎn)小鼠中，基因型分布為：203只WT小鼠、403只HZ小鼠和226只KO小鼠，性別分布為雌性441只、雄性391只。圖2B展示了三種基因型小鼠（雄性和雌性）隨時間推移的體重變化趨勢。各基因型間未觀察到顯著差異，但確實存在雄性小鼠體重增長速度快于雌性的預(yù)期趨勢。

圖2. NBCe2基因敲除小鼠品系A(chǔ)的基本特征分析。通過將攜帶floxed NBCe2等位基因的小鼠與他莫昔芬誘導(dǎo)型泛素啟動子驅(qū)動Cre表達小鼠雜交，建立完整NBCe2基因敲除小鼠模型。上圖顯示：兩只小鼠均攜帶111 bp的野生型等位基因產(chǎn)物；小鼠1攜帶133 bp的floxed（FLX）等位基因產(chǎn)物（即單側(cè)攜帶floxed NBCe2）；小鼠2則攜帶188 bp的敲除等位基因（雜合子HZ）。下圖展示雜合NBCe2品系后代的基因分型結(jié)果，子代分別表現(xiàn)為野生型（111 bp）、敲除型（188 bp）或 FLX 型（133 bp）。圖B顯示NBCe2基因敲除小鼠品系的體重增長情況，圖中呈現(xiàn)各基因型（雜合子HZ與野生型WT）雄性和雌性小鼠的個體體重觀測數(shù)據(jù)。

基因型之間體重的唯一差異在6周后的雄性小鼠中觀察到，其中NBCe2敲除和HZ雄性小鼠明顯小于NBCe2WT小鼠。這種差異在11周及以后消失。

為了驗證新型抗NBCe2抗體，對NBCe2轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細胞進行免疫染色。圖3A顯示只有轉(zhuǎn)染了NBCe2的細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)性，證實了抗體的敏感性。為了確認NBCe2的敲除，對來自NBCe2野生型和敲除小鼠的分離脈絡(luò)叢組織進行免疫印跡。抗NBCe2抗體僅在NBCe2野生型小鼠中產(chǎn)生約130kDa和260kDa的顯著條帶，分別對應(yīng)于該蛋白單體和二聚體形式的預(yù)期分子量。使用相同抗體進行的免疫組織化學(xué)染色顯示，僅在NBCe2野生型小鼠中有管腔脈絡(luò)叢上皮細胞膜結(jié)構(gòu)域染色。先前發(fā)表的NBCe2敲除小鼠揭示了參與水和鹽轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵蛋白的重組，以及脈絡(luò)叢上皮細胞中嚴重的細胞骨架重排。

我們的模型未證實這種重組。我們研究中的NBCe2敲除小鼠顯示Na+,K+-ATP酶、水通道蛋白aquaporin1和Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白NKCC1在它們通常所在的管腔質(zhì)膜中定位正常。碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白、Cl-/HCO3-交換蛋白AE2和Na+依賴性Cl-/HCO3-交換蛋白Ncbe在基底外側(cè)膜結(jié)構(gòu)域顯示正常定位。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)電中性Na+-HCO3-協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白NBCn1在管腔和基底外側(cè)膜均有表達。然而，這種定位模式在NBCe2野生型和敲除小鼠的脈絡(luò)叢上皮細胞中是相似的。還研究了α-和β-血影蛋白亞型的定位，在NBCe2野生型和敲除小鼠中顯示相似的分布。

為驗證新型抗NBCe2抗體，對NBCe2轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細胞進行免疫染色。圖3A顯示僅轉(zhuǎn)染NBCe2的細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)性，證實了該抗體的敏感性。為確認NBCe2基因敲除效果，對NBCe2野生型（WT）與敲除（KO）小鼠分離的膽管上皮（CP）組織進行免疫印跡分析（圖3B）。抗NBCe2抗體僅在NBCe2 WT小鼠中產(chǎn)生約130 kDa和260 kDa的顯著條帶，分別對應(yīng)該蛋白單體與二聚體形式的預(yù)期分子量。使用相同抗體進行免疫組化染色顯示，僅NBCe2 WT小鼠存在管腔CPE膜結(jié)構(gòu)域染色（圖3C）。既往發(fā)表的NBCe2 KO小鼠模型顯示水鹽轉(zhuǎn)運關(guān)鍵蛋白重組及CPE區(qū)嚴重細胞骨架重排，但本研究模型未觀察到該現(xiàn)象。本研究中NBCe2 KO小鼠的Na+，K+-ATP酶、水通道蛋白1（AQP1）及Na+-K+-2Cl?共轉(zhuǎn)運體NKCC1（Slc1 2 a2）在管腔質(zhì)膜中的定位均正常。

圖3：抗NBCe2抗體驗證。A，NBCe2轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的NIH-3T3細胞的代表性抗NBCe2免疫染色。NBCe2免疫熒光顯示為綠色，細胞核顯示為紅色。B，相同抗體用于對來自NBCe2野生型和敲除小鼠的脈絡(luò)叢蛋白質(zhì)樣品進行免疫印跡。C，使用相同抗NBCe2抗體對NBCe2野生型和敲除小鼠脈絡(luò)叢進行免疫熒光染色。

圖4：腦脊液分泌關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白在NBCe2野生型和敲除小鼠脈絡(luò)叢上皮細胞中的定位。在NBCe2野生型和敲除小鼠腦切片上研究了脈絡(luò)叢上皮細胞分泌腦脊液的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白的膜定位。分析了至少兩只每種基因型的小鼠。A，NBCe2野生型和敲除小鼠腦中Na+,K+-ATP酶a1亞基染色的代表性圖像。B，Na+,K+-ATP酶β1亞基的類似染色。C，免疫染色以確定AQP1在NBCe2野生型和敲除小鼠脈絡(luò)叢上皮細胞中的定位。D，兩種指定基因型中NKCC1定位的分析。在所有顯微照片中，細胞核用Topro3染色，箭頭指示管腔膜，圓圈放置在間質(zhì)組織中。

碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白、Cl?/碳酸氫鹽?交換體AE2（Slc4a2）以及Na+依賴性Cl?/碳酸氫鹽?交換體Ncbe（Slc4a10）在基底外側(cè)膜結(jié)構(gòu)域中顯示出正常定位（圖5A和B）。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)電中性Na+-碳酸氫鹽?共轉(zhuǎn)運蛋白NBCn1（Slc4a7）同時表達于管腔膜和基底外側(cè)膜。然而，這種定位模式在NBCe2野生型和敲除小鼠CPE中表現(xiàn)相似（圖5C）。 α 和 β -血影蛋白亞型的定位也經(jīng)過研究，結(jié)果顯示在NBCe2野生型和敲除小鼠中分布模式相似（未顯示）。

圖5：NBCe2野生型和敲除小鼠脈絡(luò)叢上皮細胞中碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白的定位。在NBCe2野生型和敲除小鼠腦切片上研究了脈絡(luò)叢上皮細胞中碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運蛋白的膜定位。分析了至少兩只每種基因型的小鼠。A，NBCe2野生型和敲除小鼠腦中AE2染色的代表性圖像。B，免疫染色以確定NBCe在NBCe2野生型和敲除小鼠脈絡(luò)叢上皮細胞中的定位。C，兩種指定基因型中NBCn1定位的分析。在所有顯微照片中，細胞核用Topro3染色，箭頭指示管腔膜，圓圈放置在間質(zhì)組織中。