NBCe2敲除影響脈絡(luò)叢上皮細胞中Na+依賴性酸-堿轉(zhuǎn)運

已知NBCe2以1:3的化學計量比將Na+和HCO3-從脈絡(luò)叢上皮細胞輸出到腦脊液。為了研究NBCe2對堿排出的貢獻，在SNARF負載的分離脈絡(luò)叢細胞團中監(jiān)測了細胞內(nèi)pH恢復。在含有已知細胞外pH的尼日利亞菌素的高[K+]溶液中對細胞內(nèi)pH進行校準。我們先前已用BCECF在低pHi范圍內(nèi)測定了脈絡(luò)叢的細胞內(nèi)緩沖容量。中性到堿性范圍內(nèi)的總緩沖容量如圖6C所示。在堿性pH范圍內(nèi)，固有緩沖容量的貢獻與計算得出的來自CO2/HCO3-緩沖系統(tǒng)的緩沖容量相比可以忽略不計。

圖6：NBCe2敲除小鼠脈絡(luò)叢上皮細胞的Na+依賴性酸-堿轉(zhuǎn)運。A，在485nm和555nm波長激發(fā)的SNARF負載的分離脈絡(luò)叢細胞團。B，SNARF校準實驗的軌跡，顯示激發(fā)比率隨時間的變化。通過用含有高[K+]和尼日利亞菌素的HEPES緩沖溶液灌流，將細胞內(nèi)pH值鉗制到指定的細胞外pH值。灰線顯示一次實驗的所有實驗軌跡，黑線顯示平均值。C，在相應(yīng)pHi水平下測得的固有緩沖容量圖，以及固有緩沖容量與CO2/HCO3-緩沖系統(tǒng)理論貢獻的總緩沖容量。D，在來自NBCe2敲除和野生型小鼠的SNARF負載的分離脈絡(luò)叢上皮細胞中，細胞內(nèi)pH記錄的代表性軌跡。

在不存在和存在CO2/HCO3-的情況下測定基線pHi。然后通過在持續(xù)存在CO2/HCO3-的情況下去除Cl-使細胞堿化。實驗以在pH7.5的高K+-尼日利亞菌素溶液中進行單點校準結(jié)束。點1和2指在圖E和D中計算的pH變化。E，添加CO2/HCO3-介導的pHi增加速率。F，在去除Cl-后的峰值堿化點估算的凈堿流出量平均值。G，在BCECF熒光測定法中測量的NBCe2敲除和野生型小鼠在HEPES緩沖溶液中的基線細胞內(nèi)pHi平均值。添加CO2/HCO3-引起快速的CO2誘導的酸化，隨后是由HCO3-輸入介導的新的穩(wěn)態(tài)pHi。最后，在持續(xù)存在CO2/HCO3-的情況下去除Na+，導致兩種基因型的pHi下降。

H，用BCECF負載的脈絡(luò)叢上皮細胞通過用20mMNH4ClHEPES緩沖溶液灌流進行酸化，隨后在無Na+的CO2/HCO3-緩沖溶液中沖洗，然后在存在CO2/HCO3-的情況下添加145mMNa+，在NBCe2敲除和野生型小鼠中測定dpHi/dt。實驗以在pH7.0的高K+-尼日利亞菌素溶液中進行單點校準結(jié)束。I，在峰值酸化點估算的凈酸流出量平均值。*表示統(tǒng)計學顯著性。

首先在HEPES緩沖溶液中測定細胞內(nèi)pH，然后切換到CO2/HCO3-緩沖溶液。這導致pHi的初始短暫下降，這是CO2輸入的結(jié)果，隨后由于HCO3-輸入細胞而導致pHi更持續(xù)地增加。兩種基因型之間的pHi增加沒有差異，表明缺乏NBCe2不會導致基線HCO3-轉(zhuǎn)運改變。然后通過從CO2/HCO3-緩沖溶液中去除Cl-使細胞堿化。堿化后的峰值pHi在兩種基因型中相似。堿化后的pHi恢復速率測定為峰值堿化后前20秒內(nèi)的pHi變化，預計NBCe2活性最高。確實，NBCe2野生型小鼠的平均凈堿流出量顯著高于NBCe2敲除小鼠。還在用20mM四甲基銨堿化的BCECF負載的脈絡(luò)叢上皮細胞中研究了凈堿流出。來自野生型小鼠的脈絡(luò)叢上皮細胞具有相似的總堿流出量，并且數(shù)值上高于NBCe2敲除小鼠的DIDS敏感性堿流出量，但差異無統(tǒng)計學意義。

通過在CO2/HCO3-緩沖溶液中去除Na+，在BCECF負載的分離脈絡(luò)叢細胞團中測定基線pH下的Na+依賴性HCO3-排出。在沒有CO2/HCO3-的情況下，基因型之間的基線pHi沒有差異。與使用SNARF的實驗一樣，從HEPES緩沖溶液切換到CO2/HCO3-緩沖溶液引起的細胞內(nèi)反應(yīng)在基因型之間是相似的。去除Na+引起的酸化速率在基因型之間沒有差異。

檢測NBCe2外向轉(zhuǎn)運功能重要性的另一種方法是評估NBCe2缺失對凈酸排出的影響。如果NBCe2活性通常與脈絡(luò)叢上皮細胞中酸排出蛋白的轉(zhuǎn)運活性相反，那么在來自NBCe2敲除小鼠的分離脈絡(luò)叢上皮細胞中，從酸化細胞中排出的凈酸流出量應(yīng)該會增加。用BCECF負載細胞并進行酸化。通過用BCECF負載脈絡(luò)叢上皮細胞并使用NH4Cl預脈沖酸化，然后在無Na+的CO2/HCO3-緩沖溶液中沖洗，評估了NBCe2缺失對凈酸排出的影響。在持續(xù)存在CO2/HCO3-的情況下引入Na+可以測定Na+依賴性pHi恢復速率。該值測定為添加Na+后前20秒內(nèi)的pHi變化。與野生型小鼠相比，NBCe2敲除小鼠脈絡(luò)叢上皮細胞的平均Na+依賴性酸流出量高出6倍。這表明，當NBCe2缺失時，在酸化細胞中，堿輸入蛋白（如HCO3-輸入蛋白Ncbe和NBCn1）的貢獻增加。總之，結(jié)果表明NBCe2在高pHi時是一個重要的堿排出蛋白，而在基線和低pHi時，NBCe2對堿排出的貢獻不顯著。細胞內(nèi)酸化后增強的pHi恢復表明其他HCO3-輸入蛋白的活性增加。

NBCe2敲除和野生型小鼠對5%CO2表現(xiàn)出相似的呼吸反應(yīng)

使用氣壓測量法測定了NBCe2敲除和野生型小鼠在高碳酸血癥期間的呼吸頻率和潮氣量。吸入5%CO2引起NBCe2野生型和敲除小鼠潮氣量和呼吸頻率的顯著增加。在基線條件下或5%CO2暴露期間，基因型之間的潮氣量或呼吸頻率沒有統(tǒng)計學上的顯著差異。在基線條件下，NBCe2敲除小鼠與野生型相比顯示正常血漿pH值。然而，與野生型相比，敲除小鼠的PaCO2和標準HCO3-降低。