NBCe2 KO和NBCe2 KD會減弱急性呼吸性酸中毒期間腦脊液pH的恢復

為研究NBCe2在酸化過程中調節腦脊液pH的作用，將pH微電極置于麻醉小鼠的側腦室中。圖7C顯示了NBCe2 WT小鼠在腦室內注射鹽酸前后以及在回撤和重新引入操作期間獲得的腦脊液pH曲線示例。

無論是使用玻璃pH電極還是光學微傳感器，在注射HCl時均觀察到腦脊液pH出現短暫且可重復的下降，而電極或微電極的撤出和重新置入操作并未影響記錄。吸入5%二氧化碳會導致呼吸性酸中毒，已知這會直接影響腦脊液pH。因此，NBCe2野生型（WT）和基因敲除（KO）小鼠在記錄腦脊液pH的同時接受了30分鐘5%二氧化碳吸入（圖7D）。

NBCe2 WT與KO小鼠的基線腦脊液pH無顯著差異（NBCe2 WT 7.19 ± 0.24（n = 5），NBCe2 KO 7.18 ± 0.20（n = 7），P = 0.95）。兩種基因型在引入和移除5%二氧化碳時腦脊液pH的偏轉幅度也相似（pH下降：NBCe2 WT ?0.018 ± 0.006 pH單位，NBCe2 KO WT 0.023 ?0.013 ± ± 0.002 pH單位，0.003 pH單位，NBCe2 KO 0.027 P = 0.34；pH上升：NBCe2 ± 0.003 pH單位，P = 0.39）。

在快速CO2誘導的腦脊液pH下降后，僅在NBCe2 WT小鼠中觀察到緩慢的pH恢復（圖7D）。腦脊液pH恢復速率在最大酸化后20分鐘內測定，NBCe2 WT小鼠的恢復速率顯著高于NBCe2 KO小鼠（圖7E；WT組n = 5，KO組n = 7，P = 0.01）。為支持NBCe2 KO模型的觀察結果并排除體內其他部位NBCe2破壞的影響，我們在腦脊液pH測量前48小時通過腦室內注射Slc4a5 siRNA，特異性靶向脈絡叢和室周組織中的NBCe2。圖7F顯示，通過qPCR分析（n = 4，P = 0.0497），與對照組（RLuc siRNA）相比，注射靶向NBCe2 siRNA的小鼠在24小時后NBCe2 mRNA豐度降低；而注射NBCe2 siRNA的小鼠在6小時和48小時后的NBCe2 mRNA水平與對照組無顯著差異（n = 4，無統計學意義）。

然而在蛋白質水平上，siRNA注射48小時后觀察到管腔膜NBCe2豐度降低。圖7G和H分別顯示了針對RLuc和Slc4a5（NBCe2）的siRNA注射48小時后小鼠CPE的免疫組化染色結果。對siRNA注射小鼠中NBCe2蛋白水平對應的熒光強度進行半定量分析表明，48小時后蛋白表達量約降低60%（n = 2）。基于蛋白質分析結果，選擇注射后48小時作為功能測量時間點。與NBCe2 KO小鼠類似，NBCe2 KD小鼠的基礎腦脊液pH值未見顯著差異（對照組pH = 7.36 ± 0.07，n = 9；注射后24小時pH = 7.35 ± 0.09，n = 8；注射后48小時pH = 7.34 ± 0.05，n = 6）。與注射RLuc siRNA的對照組小鼠相比，NBCe2 KD小鼠在酸中毒期間表現出幾乎完全消失的腦脊液pH恢復（圖7I；P = 0.044，野生型小鼠n = 5，KD小鼠n = 8）。

圖 7： NBCe2 敲除和野生型小鼠對高碳酸血癥的通氣反應和腦脊液 pH 恢復。A 和 B，在室內空氣和吸入 5% CO2 期間測定 NBCe2 敲除和野生型小鼠的潮氣量和呼吸頻率，以確認兩種基因型對 5% CO2 暴露具有相似的通氣反應。C，腦室內腦脊液 pH 記錄驗證。將玻璃電極或光學電極插入麻醉小鼠的側腦室。箭頭指示向對側腦室注射 1 μl 5 mM HCl 的時間。D，在 NBCe2 敲除和野生型小鼠中，吸入 5% CO2 之前、期間和之后的體內腦脊液 pH 記錄的代表性軌跡。

圖顯示每分鐘平均 pH 值。E，NBCe2 敲除和野生型小鼠在吸入 5% CO2 的恢復階段最后 20 分鐘內的平均腦脊液 pH 恢復速率。F-H，siRNA 敲低驗證。通過 qPCR 和半定量免疫組織化學評估 siRNA 方法敲低 NBCe2 的效率。F，柱狀圖描繪了注射靶向 Slc4a5 的 siRNA 后 6 小時、24 小時和 48 小時，相對于注射 RLuc 對照小鼠的 Slc4a5 mRNA 表達。G，注射對照 siRNA 后 48 小時，NBCe2 免疫組織化學染色的代表性示例。H，注射 NBCe2 siRNA 后 48 小時獲得的類似圖像，示例了 NBCe2 的染色。I，圖顯示注射靶向 Slc4a5 mRNA 的 siRNA 或對照 RLuc siRNA 的小鼠，在 5% CO2 吸入恢復階段最后 20 分鐘內的平均腦脊液 pH 恢復速率。*P < 0.05。