NBCe2基因敲除小鼠對癲癇發作的發生無保護作用

在癲癇發作期間，由于局部缺氧，腦組織間質pH值會降低。若癲癇發作由堿性腦pH值引起（例如熱性驚厥期間），這種pH值的降低會促進癲癇發作的中斷。

因此，癲癇活動似乎取決于腦組織間質液對酸堿變化的響應能力。由于NBCe2基因敲除小鼠的腦脊液pH值在酸中毒時恢復幅度顯著較小，且孤立的CP細胞在堿中毒時堿排出不足，理論上NBCe2基因敲除小鼠可能對癲癇發作的發展具有更好的保護作用。因此，如方法部分所述，對注射 PTZ 或熱處理的小鼠進行了錄像并記錄癲癇發作情況。

總體而言，根據雌性（n=5；圖8A）和雄性（n=5；圖8B）小鼠癲癇發作發展的時間進程判斷，NBCe2基因敲除小鼠對 PTZ 誘導的癲癇發作并無保護作用。然而，與NBCe2野生型小鼠相比，雄性NBCe2基因敲除小鼠出現3期癲癇發作（肌陣攣抽搐/后仰）的時間顯著延長（P=0.0008）。在雌性組中，盡管數值非常接近，NBCe2基因敲除小鼠進入2期癲癇發作的時間滯后期較NBCe2野生型小鼠具有統計學顯著縮短（P=0.04）。

圖8： NBCe2 敲除和野生型小鼠的癲癇發作敏感性。小鼠腹腔注射戊四氮并觀察長達 60 分鐘。癲癇發作活動測定為從注射 PTZ 到首次出現每個癲癇發作活動評分的時間。C，小鼠接受由加熱誘導的過度通氣性癲癇發作挑戰。圖顯示從開始加熱到首次觀察到癲癇發作的平均潛伏時間。

在相同實驗中，雄性和雌性小鼠在20分鐘后的最高評分在不同基因型間無顯著差異，但癲癇發作評分似乎存在性別差異趨勢：雄性小鼠評分高于雌性（平均評分：雌性NBCe2野生型2.7±0.85，雌性NBCe2基因敲除組3±0.94；雄性NBCe2野生型4.6±0.24，雄性NBCe2基因敲除組4.5±0.22，P=0.12）。

經熱處理的過度換氣小鼠中，NBCe2基因敲除組小鼠癲癇發作前的時間延遲趨勢更長（圖8C；野生型n=6，基因敲除組n=7，P=0.0935）。然而通過單位時間跳躍次數評估發現，NBCe2基因敲除組小鼠在逃避行為中的體力活動顯著降低（P=0.0039）。

討論

通過在新型 NBCe2 敲除小鼠模型中利用連續的體內腦脊液 pH 記錄，并通過使用 siRNA 敲低特異性靶向大腦中的 NBCe2，我們確定了第一個參與血-腦脊液屏障腦脊液 pH 調節的酸-堿轉運蛋白。自從 1977 年 Husted 和 Reed 表明腦脊液 HCO3- 濃度由脈絡叢上皮細胞主動調節以來，人們一直認為脈絡叢上皮細胞中的酸-堿轉運過程會參與調節腦脊液 pH 值。我們假設，NBCe2 作為脈絡叢上皮細胞中有效的碳酸氫鹽排出蛋白，可能是一種合適的使腦脊液 pH 值堿化的機制。我們證明，在早期呼吸性酸中毒期間，NBCe2 對于恢復腦脊液 pH 值是至關重要的，并且這種效應不是由總體表型、呼吸頻率或潮氣量的差異引起的。

已知 NBCe2 以 1:3 的化學計量比從脈絡叢上皮細胞跨管腔質膜輸出 Na+ 和 HCO3-，因此預計在典型的膜電位值下，例如在細胞外酸化或細胞內堿化期間活性最高。我們在堿性 pHi 下使用 SNARF 在 NBCe2 敲除小鼠中進行細胞內 pH 測量的結果表明，與野生型小鼠脈絡叢上皮細胞相比，在存在 CO2/HCO3- 的情況下，NBCe2 敲除小鼠的凈堿排泄減少。使細胞堿化的操作具有防止陰離子交換蛋白 AE2 在 pH 恢復期間排出堿基的優點。

在用 TMA 堿化的 BCECF 負載細胞的實驗中，我們觀察到 NBCe2 敲除脈絡叢上皮細胞中堿排出量的數值減少，并且對二異硫氰酸芪二磺酸敏感，盡管差異無統計學意義。BCECF 在高 pHi 范圍內的靈敏度低于 SNARF，這導致更大的標準誤差。然而，NBCe2 野生型脈絡叢上皮細胞的總堿流出量以及殘余堿流出量的數值在兩種實驗方法之間高度相似。盡管 BCECF 方法缺乏顯著差異值是我們研究中的一個弱點，但我們相信 SNARF 實驗的結果、通過去除 Cl- 分離 NBCe2 功能以及我們的體內數據強烈表明 NBCe2 是一種 Na+-HCO3- 排出蛋白，從而證實了先前的研究。

在基線和酸性條件下研究了 NBCe2 對酸-堿調節的貢獻。在基線條件下，添加 CO2/HCO3- 導致基因型之間相似的堿化速率。此外，在存在 CO2/HCO3- 的情況下去除 Na+ 導致兩種基因型中相似的向外的 Na+ 驅動的 HCO3- 轉運。在酸性條件下，結果不那么容易解釋。堿排出蛋白在酸性條件下不太可能具有活性，此時酸排出蛋白的活性很高。因此，在 NBCe2 敲除模型中去除堿排出蛋白預計不會導致酸排出的差異。

然而，當比較酸中毒后來自 NBCe2 野生型和敲除小鼠的分離脈絡叢上皮細胞的 pHi 恢復時，缺乏堿排出蛋白 NBCe2 似乎大大增加了 Na+ 依賴性酸排出蛋白（如 Ncbe、NBCn1 和 NHE）的表現活性。在酸-堿轉運蛋白表達沒有代償性變化的情況下，我們將增加的 pHi 恢復率解釋為 NBCe2 敲除脈絡叢上皮細胞中功能上增強的 Na+ 依賴性酸排出。總之，我們證實 NBCe2 是脈絡叢上皮細胞中的一種堿排出蛋白，可在堿化后的 pHi 記錄中檢測到。盡管先前已通過電生理學方法在基線 pHi 下觀察到 NBCe2 活性本身，但我們的基線 pHi 實驗表明 NBCe2 不參與設定靜息 pHi。

如上所述，提出了一種將堿當量輸入腦脊液的機制，以解釋在全身性酸-堿紊亂期間，盡管腦脊液中缺乏蛋白質緩沖，但腦脊液 pH 值的變化不會超過血漿 pH 值的變化。然而，介導這種跨血-腦屏障或血-腦脊液屏障轉運的蛋白質的分子身份直到現在仍然不清楚。為了測試 NBCe2 是否參與腦脊液 pH 調節，有必要建立一種體內連續記錄腦脊液 pH 的方法。據我們所知，這是該方法首次用于評估腦脊液 pH 變化，盡管先前已進行過腦組織和基線腦脊液 pH 的體內 pH 測量。