摘要

微電極陣列是用于以多通道格式研究心肌細胞細胞外電生理學的重要工具。然而，它們通常缺乏記錄細胞內動作電位的能力。最近的研究依賴于結合電穿孔的高分辨率微電極的昂貴制造來進行細胞內記錄，但微電極尺寸對微電穿孔和細胞內信號采集質量的影響尚未被探索。了解這些效應可以促進各種尺寸微電極的設計，以實現(xiàn)更低成本的制造工藝。在本研究中，我們通過模擬和實驗研究了微電極尺寸對微電穿孔后細胞內動作電位參數(shù)和記錄指標的影響。

我們使用標準光刻技術制造了不同尺寸的微電極，通過耦合微電穿孔記錄來自不同培養(yǎng)環(huán)境的心肌細胞動作電位。我們的研究結果表明，較大的微電極通常記錄到的電生理信號幅度更高，信噪比更好，而較小的電極則表現(xiàn)出更高的穿孔效率、動作電位持續(xù)時間和單細胞信號比例。這項工作表明，微電穿孔技術可以應用于較大的微電極進行細胞內記錄，而不僅限于高分辨率設計。這種方法可能為使用替代性低成本制造技術制造微電極以進行高質量細胞內動作電位記錄提供新的機會。

引言

記錄具有電生理特性的細胞的動作電位對于理解亞細胞功能原理和推進藥物開發(fā)具有重要意義。這對于心肌細胞尤其如此，因為與細胞外場電位相比，動作電位信號提供了更豐富的細胞功能信息。動作電位持續(xù)時間、去極化速率和復極化時間等關鍵參數(shù)是心肌細胞心律失常的重要預測因子。在心肌細胞的電生理監(jiān)測中，細胞外場電位反映了由于各種離子濃度疊加變化而附著在電極上的細胞簇的時空電活動。細胞外場電位信號揭示的關鍵電生理參數(shù)是場電位持續(xù)時間和搏動頻率。相比之下，細胞內動作電位捕獲了心肌細胞在收縮過程中隨時間變化的膜電位變化，從而能夠量化快速去極化和復極化速率。此外，細胞內動作電位的變化與心臟的興奮傳導和收縮功能直接相關。因此，可靠且高通量的方法來檢測細胞內動作電位對于全面理解心臟發(fā)病機制和有效的藥物篩選至關重要。

膜片鉗技術被認為是檢測細胞電信號的金標準，全細胞膜片鉗能夠測量細胞內動作電位。此外，電壓敏感染料有助于觀察單個和多個心肌細胞的細胞動作電位。然而，膜片鉗方法通量低，并且可能對能夠測量細胞內（信號）的全細胞膜片鉗造成不可逆的損傷，并且需要復雜的實驗裝置以及顯微鏡操作系統(tǒng)。使用微加工技術制造的微電極陣列能夠同時從多個細胞進行長期記錄，并且允許直接在微電極陣列上培養(yǎng)細胞，增強了用戶友好性。

為了改善細胞-微電極耦合和電生理信號測量的質量，已經(jīng)開發(fā)了具有納米結構的被動和主動納米級電極陣列。細胞膜與納米電極的緊密接觸減少了間隙，從而增強了封接阻抗，并產(chǎn)生高質量的細胞外場電位記錄。雖然微電極陣列通常由于與細胞膜的非侵入性接觸而只能檢測細胞外場電位，但具有三維納米結構的微電極已被用于捕獲能提供更詳細信息的細胞內電生理信號。例如，用磷脂分子修飾的納米尖端和納米線微電極可以穿透心肌細胞以進行細胞內動作電位記錄。然而，無論是通過重力還是化學修飾，這種穿孔是隨機的，并可能導致不可逆的細胞損傷。

因此，更可靠的細胞穿孔方法可以通過局部穿孔與物理力相結合來實現(xiàn)，從而能夠以低阻抗記錄細胞內動作電位。Dipalo等人報道了使用激光刺激3D等離子體納米電極和模糊石墨烯微電極進行細胞膜穿孔，允許進行細胞內動作電位檢測。然而，耦合激光進行光穿孔需要一個復雜的光學系統(tǒng)，并且由于細胞膜光穿孔基于光熱效應，對微電極陣列微電極的材料要求更為嚴格。生物電子平臺已經(jīng)證明，施加脈沖電壓有可能使細胞產(chǎn)生可逆的納米孔，這可以實現(xiàn)額外的功能，例如細胞轉染或細胞電位檢測。

例如，Wu等人使用直流刺激來增強轉染細胞中愈合因子的分泌并加速腸道愈合。Jahed等人提出，垂直排列的納米冠電極結合電穿孔可以連續(xù)多天記錄細胞中的細胞內動作電位。相比之下，電穿孔與電信號檢測系統(tǒng)更兼容，因為微電極不僅可以作為電信號檢測的媒介，還可以發(fā)射電脈沖用于細胞膜電穿孔。

為了檢測單個細胞內的動作電位，通常在使用微/納制造技術絕緣電極后獲得直徑小于10微米的微電極。Viswam等人使用小于10微米的微電極陣列電極探測了局部場電位和細胞外動作電位。較小的電極需要更高的加工精度，這使得微/納制造過程更加復雜。雖然較小的電極與心肌細胞具有更高的封接電阻，這可以最大限度地減少電流泄漏并通過降低背景噪聲來提高信號質量。較大的電極往往具有較低的阻抗，這可以減少熱噪聲并提高信噪比。

因此，如何平衡電極暴露區(qū)域的大小對于檢測細胞內外電信號的質量非常重要。雖然已經(jīng)檢測到單細胞電信號，但目前的研究主要集中在細胞-納米電極耦合對這些信號記錄的影響上。值得注意的是，缺乏研究探討微米級電極暴露區(qū)域在檢測心肌細胞細胞內動作電位方面的差異。因此，系統(tǒng)地研究電極尺寸如何影響信噪比、穿孔效率和動作電位持續(xù)時間等心肌細胞參數(shù)至關重要。

此外，在技術層面上，電極尺寸精度的降低使微電極陣列的加工更容易獲得，為研究人員在檢測細胞電信號方面提供了更大的靈活性。例如，可以使用諸如掩模版蒸發(fā)沉積、絲網(wǎng)印刷、噴墨印刷和激光蝕刻等技術，以通常大于20或100微米的精度制造電極。如果這些較大尺寸的電極能夠有效地穿透細胞膜并成功記錄細胞內動作電位，那么微電極陣列的制備過程將變得更加多樣化和適應性強。

在這項工作中，我們描述了不同微米尺寸的微電極對細胞內動作電位信號質量和細胞內記錄指標參數(shù)的影響。首先，我們通過無源電路模擬模型確定，在細胞膜阻抗降低后，使用平面電極記錄的心肌細胞電生理信號波形與細胞內動作電位波形一致。接下來，通過三維模擬模型優(yōu)化了電穿孔電壓，并探討了電極尺寸對跨膜電壓、電流密度和電場強度的影響。在我們的實驗中，我們使用標準光刻工藝制造了不同尺寸的微電極陣列（包括混合尺寸微電極陣列和多尺寸微電極陣列）。

通過將這兩種類型的微電極陣列與微米電穿孔耦合，記錄了不同培養(yǎng)環(huán)境中心肌細胞的細胞內動作電位。對電生理信號的分析表明，電極的阻抗對細胞內動作電位的幅度和信噪比影響更大。隨著微電極尺寸的增加，細胞內動作電位的幅度和信噪比分別增加了高達220%和70%。跨膜電壓和電場強度更多地影響了穿孔效率、動作電位持續(xù)時間和記錄到的單細胞信號比例。隨著微電極尺寸的增加，穿孔效率、動作電位持續(xù)時間和記錄到的單細胞信號比例分別降低了高達18.8%、17.5%和19.5%。在3V的電穿孔電壓下，不同尺寸的微電極對心肌細胞的自調節(jié)沒有顯著影響。

這項工作表明，微電穿孔技術可以應用于各種尺寸的微電極，實現(xiàn)超越高分辨率微電極限制的細胞內記錄。通過使該技術適應較大的微電極，為使用更具成本效益的制造方法制造能夠進行高質量細胞內動作電位記錄的微電極提供了新的機會。這種方法有潛力增強基于微電極陣列的細胞內記錄設備和實驗設置的靈活性。