實驗方法

用于制造多尺寸微電極陣列芯片的光掩模設計

光掩模用作多尺寸微電極陣列芯片光刻工藝的掩模。我們使用AutoCAD軟件為微電極圖案化和封裝層圖案化光刻工藝分別設計了5x5微電極陣列陣列掩模版。為了避免細胞生長狀態和不同尺寸微電極對電生理信號記錄的影響，5x5微電極陣列陣列掩模版包含兩種類型的微電極陣列：一種是在同一基底上混合不同尺寸微電極，每個基底包含8個通道的20微米微電極、8個通道的50微米微電極、8個通道的100微米微電極、4個通道的200微米微電極和4個通道的400微米微電極。我們稱之為混合尺寸微電極陣列。另一種是在不同基底上具有不同尺寸的微電極，每個基底包含32個通道的20、50、100、200和400微米微電極。我們稱之為多尺寸微電極陣列。為了防止上述兩種類型微電極陣列中的相鄰電極從同一細胞獲取電信號，相鄰微電極邊緣之間的最小距離為250微米。光掩模分包由深圳安美電子有限公司完成。

多尺寸微電極陣列芯片的制造

使用標準光刻工藝制造多尺寸微電極陣列芯片，微加工由上海納敏芯科技有限公司完成。微電極陣列芯片制造在4英寸方形玻璃基底上。最初，每個基底使用食人魚溶液清洗，然后用去離子水清洗。隨后，使用氮氣干燥基底，并在120°C的熱板上預熱15分鐘。冷卻至室溫后，用氮氣吹掃去除任何殘留的灰塵。然后進行表面活化處理，將光刻膠旋涂到玻璃基底上，然后通過梯度速度烘焙。使用光刻機以25 mJ/cm2的劑量曝光微電極圖案。曝光后，將芯片取出并在110°C的熱板上放置3分鐘，然后在室溫下冷卻3-5分鐘。接下來，將芯片放入光刻機中以25 mJ/cm2的劑量進行泛曝光，然后用顯影液顯影45秒。然后，用超純水清洗芯片2-3次，在基底上形成暴露的微電極圖案。

接下來，用等離子體蝕刻芯片表面以清潔芯片表面并增加親水性。通過磁控濺射沉積Cr/Au層，并用丙酮剝離光刻膠以形成微電極。在微電極表面以梯度速度旋涂負性光刻膠SU-8 2005，然后使用熱板進行前烘。使用光刻機以110 mJ/cm2的劑量曝光封裝層圖案，然后使用熱板后烘6分鐘，然后在SU-8顯影液中顯影1分鐘，然后用異丙醇清洗以形成絕緣層。接下來，將器件在150°C下烘烤10分鐘。最后，通過將4英寸方形玻璃基底切割成25個2x2平方厘米的微電極陣列芯片來制造微電極陣列芯片。

多尺寸微電極陣列器件的制造

該過程涉及使用聚二甲基硅氧烷將微電極陣列芯片固定到定制的印刷電路板上，并使用導電銀膠將32個微電極連接到印刷電路板上。隨后，使用聚二甲基硅氧烷將一個寬1厘米、高1.5厘米的玻璃環粘在器件中心作為細胞培養室。將參比電極固定到塑料蓋上并連接到印刷電路板以進行電連接。最后，將一排引腳接口焊接到印刷電路板上，以匹配電生理信號采集系統的接口。這種多尺寸微電極陣列器件使用一個公共參比電極進行電生理信號記錄和微電穿孔。

電化學表征

使用電化學工作站（CHI760E, CH Instruments）在三電極設置中進行循環伏安法和電化學阻抗譜實驗。為了將微電極連接到電解質，將含有5x10-3 M [Fe(CN)6]3-/4-的10x10-3 M PBS電解質添加到培養孔中。在該配置中，Ag/AgCl電極、Pt電極和金微電極分別用作參比電極、對電極和工作電極。循環伏安法在-0.4至0.4 V的電位范圍內以100 mV/s的掃描速率進行。電化學阻抗譜在1 MHz至1 Hz的頻率范圍內進行。對每種幾何形狀的n=4個微電極的數據進行了分析，并以均值±標準誤差表示。

新生大鼠心室肌細胞的分離和培養

所有動物實驗均按照中山大學機構動物護理和使用委員會批準的程序進行。從1-3天內的SD大鼠心臟收集新生大鼠心室肌細胞。在典型的新生大鼠心室肌細胞分離步驟中，從無菌乳鼠中分離心臟，并用PBS清洗。然后將心臟在D-Hank's溶液中切成約1立方毫米的小塊，溶解在含有0.07%胰蛋白酶和0.05%II型膠原酶的D-Hank's溶液中，重復消化直至組織分解。將器件在75%乙醇中消毒，并在紫外線照射下滅菌2小時。然后，將5微克/毫升的纖連蛋白涂層應用于所有玻璃基底，并孵育2小時。在孵育結束時，吸出纖連蛋白。最后，將心肌細胞懸液重懸于5毫升培養基中，以大約每平方毫米1.5x10^4個細胞的密度將細胞接種在微電極表面。細胞培養基是DMEM高糖培養基、10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的混合物。心肌細胞在37°C和5% CO2下培養。在培養期間，每2天更換一次心肌細胞的培養基。

細胞-微電極界面微電穿孔模型模擬

為了探索合適的微電穿孔電壓以及了解細胞位置對跨膜電壓的影響，構建了三維細胞-電極模型，并使用COMSOL Multiphysics 6.0軟件中的電流模塊進行了有限元模擬。在模擬中，精確設置了細胞在微電極上的不同位置，包括完全耦合到微電極表面、部分耦合以及完全耦合到封裝層表面的情況。基于實際光學圖像構建了三維模型，該模型考慮了心肌細胞在微電極表面及其以外區域的分布。模型始于2毫米厚的玻璃基底，然后是10納米厚的微電極，非電極區域是2微米厚的SU-8絕緣層。然后將直徑為80微米的細胞耦合在金微電極或封裝層表面，細胞膜厚度為10納米，心肌細胞與生長界面之間有100納米的間隙。

模型的其余區域定義為培養基，并在其上方設置了參比電極。在物理場設置中，整個模型遵循電流守恒定律。結合這些方程，使用拉普拉斯方程來計算電勢分布。在探索合適的電穿孔電壓時，通過微電極向完全耦合到微電極表面的心肌細胞施加1-5V的電穿孔電壓。在模型達到穩態后，觀察細胞的跨膜電壓。在探索細胞生長位置對跨膜電壓的影響時，通過微電極向生長在不同微電極位置的細胞施加3V的電穿孔電壓。在模型達到穩態后，觀察生長在不同微電極位置的細胞的跨膜電壓。為了定量分析細胞膜上的跨膜電位，我們構建了五個三維截線，每個截線長度為80微米，間距為10微米。這些參考線從玻璃基底底部向上穿過心肌細胞。在統計分析中，提取沿每個參考線的電勢分布，并計算代表參考線穿過細胞膜兩側的電位差。