微電穿孔和細胞內動作電位記錄的模擬

微電極陣列通過向微電極表面施加電壓來記錄心肌細胞的細胞內動作電位。微電極表面局部電場的過程在細胞膜上產生瞬時納米孔，細胞膜阻抗降低，因此微電極記錄到動作電位。為了深入了解微電穿孔前后電信號波形的變化，使用Multisim軟件模擬了細胞-電極界面的無源電路模型。該模型的等效電路基于電阻-電容并聯元件，由三個主要部分組成：心肌細胞、細胞與金微電極之間的間隙以及金微電極本身（圖2a, b）。

圖2. 用于細胞內動作電位記錄的微電穿孔模擬。

a, b 細胞-電極接口的等效電路圖，以及其在微電穿孔前后對應狀態下的元件值。

c 動作電位模擬。 (i) 原始動作電位波形。(ii) 模擬的微電穿孔前細胞外場電位波形。(iii) 模擬的微電穿孔后細胞內動作電位波形。

d, e 模擬兩個細胞耦合到一個電極的情況。(d) 兩個細胞在一個微電極上的耦合示意圖。(e) 模擬的兩個細胞耦合到一個微電極時的雙峰動作電位波形。

f 心肌細胞在微電極上隨機分布的光學顯微鏡圖像。

g 細胞與不同尺寸微電極耦合的模擬模型示意圖。(i) 小尺寸，(ii) 中尺寸，(iii) 大尺寸微電極。

h 用于模擬的細胞-微電極三維模型。

i-k 在3V電壓下，細胞耦合到不同尺寸微電極時的電勢分布模擬結果：(i) 20微米，(j) 100微米，(k) 400微米微電極。

l-n 用于提取電勢的垂直參考線位置：(l) 20微米，(m) 100微米，(n) 400微米微電極。

o-q 沿圖l-n所示參考線的電勢分布，以及計算得到的跨膜電壓。

r-t 在3V電壓下，細胞耦合到不同尺寸微電極時的電流密度分布（上部）和電場模量分布（下部）模擬結果：(r) 20微米，(s) 100微米，(t) 400微米微電極。

具體來說，該模型從上到下包括：細胞上表面細胞膜與細胞外溶液之間的非連接膜（非連接電容和電阻記為Cnj, Rnj）。細胞下表面細胞膜與金微電極之間的連接膜（連接電容和電阻記為Cj, Rj）。這一部分代表了心肌細胞通過磷脂膜上的粘附分子與金微電極上的纖連蛋白相互作用而緊密耦合。細胞與金微電極之間的間隙充滿了離子溶液，由封接電阻Rseal表示。最后，還有一個用于信號傳輸和記錄的前置放大器。動作電位的產生與心肌細胞連接膜和非連接膜中離子通道的切換和移動有關。在模擬中，將標準方法獲得的動作電位用作原始動作電位（圖2c(i)）。在微電穿孔之前，細胞膜的Cj和Rj較高。模擬的細胞外場電位在波形特征上與同步記錄的細胞外場電位相似，顯示出經典的雙相脈沖模式（圖2c(ii)）。

在微電穿孔期間，細胞膜中形成微小的瞬時納米孔，導致Cj和Rj均降低。此時，模擬的細胞內動作電位與同步記錄的細胞內動作電位波形相似；兩者都顯示出典型的去極化、復極化和靜息期特征（圖2c(iii)）。因此，基于微電穿孔技術使用較大尺寸微電極進行細胞內動作電位記錄在理論上得到了驗證。在記錄細胞內動作電位時，每個微電極記錄到的信號應對應于單個細胞。為了探索當多個細胞耦合到同一微電極時對記錄波形的影響，設計了一個電路模型（圖2d）。如圖2e所示，當兩個心肌細胞耦合到同一微電極時，記錄到的信號顯示出雙峰現象。這是因為兩個心肌細胞之間的動作電位傳播存在時間滯后。

為了優化電穿孔電壓并理解微電極尺寸對電穿孔過程中電行為的影響，使用COMSOL Multiphysics軟件進行了三維模擬。光學顯微鏡圖像顯示，心肌細胞隨機分布在微電極表面（圖2f）。在模擬中，設置了細胞與不同尺寸微電極的耦合，包括細胞耦合到小尺寸微電極表面、細胞耦合到中等尺寸微電極表面以及細胞耦合到大尺寸微電極表面的情況（圖2g）。如圖2h所示，模擬的心肌細胞直徑設為80微米，細胞膜設為10納米厚的邊界層，并在細胞-介質界面設置了100納米的間隙。微電極由位于2毫米厚SiO2基底上的100納米金層組成，參比電極位于金微電極正上方，浸沒在培養基中。

為了篩選合適的電穿孔電壓，在模型中對微電極表面施加1-5V的電壓。然后觀察細胞及其周圍環境的電勢分布，并統計細胞膜兩側的跨膜電壓大小。如圖2j所示，隨著施加電壓的增加，細胞膜兩側的電勢差值逐漸增加。如圖2m所示，為了定量分析跨膜電壓，在模擬模型中設置了垂直參考線（1-5）和參考點（a-j）。

通過統計參考線的電勢來計算參考點處的跨膜電壓（圖2p）。通過增加微電穿孔電壓的幅度（1至5V），當微電穿孔電壓為3V時，細胞膜兩側的跨膜電壓大于1.2V，這可以穿孔細胞膜。獲得模擬優化的電壓后，我們使用自建的電生理信號數據采集系統進行細胞內動作電位記錄測試，該系統可控制脈沖生成。我們獲得了在1-5V脈沖電壓電穿孔后心肌細胞的細胞內動作電位。當微電穿孔電壓為3V時，該電壓可以高效地（84.28%）穿孔細胞膜，而不會顯著影響心肌細胞的搏動頻率。

在探索電極尺寸對電穿孔電行為的影響時，我們在模型中向電極施加了3V的電壓。模型顯示，隨著電極尺寸的增加，細胞膜兩側的電勢變化變得不那么明顯（圖2i-k）。我們提取了沿參考線（圖2l-n）的電勢并計算了跨膜電壓（圖2o-q）。結果表明，隨著電極尺寸的增加，跨膜電壓從1.69V降低到1.21V。電流密度分布顯示，電極尺寸越大，電流越容易從無細胞覆蓋的區域泄漏（圖2r-t，上部）。電場模量分布顯示，電極尺寸越大，細胞膜區域的場強越小（圖2r-t，下部）。

隨著電極尺寸的增加，參考點處的平均電場模量從16.12 V/微米降低到11.35 V/微米。我們還探討了細胞生長點處穿孔的可能性。模擬結果表明，當心肌細胞與微電極表面的耦合面積減小時，細胞膜底部兩側的電勢差表現出跨膜電位差減小的趨勢。我們同樣提取了沿參考線的電勢，并統計了參考點處的跨膜電壓。結果表明，當心肌細胞完全耦合到微電極時跨膜電壓最高，這使得實現微電穿孔最容易。