微電穿孔前后波形和幅度的評估

基于對微電極的表征和模擬，發(fā)現(xiàn)微電極的尺寸可能影響電信號記錄的質(zhì)量。因此，研究微電極尺寸對細(xì)胞內(nèi)動作電位記錄的影響至關(guān)重要。在此基礎(chǔ)上，我們使用微加工工藝在不同基底上制造了具有不同尺寸（20、50、100、200和400微米）微電極的微電極陣列，并將其命名為多尺寸微電極陣列。將多尺寸微電極陣列制作成器件用于培養(yǎng)心肌細(xì)胞，培養(yǎng)3天后，心肌細(xì)胞已形成匯合的單層并開始同步搏動。

圖3. 多尺寸微電極陣列連續(xù)記錄心肌細(xì)胞的細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位。

a-e 20、50、100、200和400微米微電極陣列的顯微圖像。

f 在20微米微電極陣列連續(xù)記錄的典型心肌細(xì)胞細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位。

g 在微電穿孔后約36秒，動作電位幅度衰減至其最大值的70%。在微電穿孔后約68秒，記錄到的信號波形開始出現(xiàn)場電位波形特征。在微電穿孔后約142秒，記錄到的信號恢復(fù)到細(xì)胞外場電位的幅度和形狀。

h 在50微米微電極陣列連續(xù)記錄的典型心肌細(xì)胞細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位。

i 在微電穿孔后約25秒，動作電位幅度衰減至其最大值的70%。在微電穿孔后約70秒，記錄到的信號波形開始出現(xiàn)場電位波形特征。在微電穿孔后約229秒，記錄到的信號恢復(fù)到細(xì)胞外場電位的幅度和形狀。

j 在100微米微電極陣列連續(xù)記錄的典型心肌細(xì)胞細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位。

k 在微電穿孔后約18秒，動作電位幅度衰減至其最大值的70%。在微電穿孔后約75秒，記錄到的信號波形開始出現(xiàn)場電位波形特征。在微電穿孔后約160秒，記錄到的信號恢復(fù)到細(xì)胞外場電位的幅度和形狀。

l 在200微米微電極陣列連續(xù)記錄的典型心肌細(xì)胞細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位。

m 在微電穿孔后約32秒，動作電位幅度衰減至其最大值的75%。在微電穿孔后約53秒，記錄到的信號波形開始出現(xiàn)場電位波形特征。在微電穿孔后約191秒，記錄到的信號恢復(fù)到細(xì)胞外場電位的幅度和形狀。

n 在400微米微電極陣列連續(xù)記錄的典型心肌細(xì)胞細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位。

o 在微電穿孔后約25秒，動作電位幅度衰減至其最大值的75%。在微電穿孔后約68秒，記錄到的信號波形中開始出現(xiàn)細(xì)胞外場電位的波形特征。在微電穿孔后約197秒，記錄到的信號恢復(fù)到細(xì)胞外場電位的幅度和形狀。

p-s 統(tǒng)計圖：(p) 細(xì)胞內(nèi)動作電位峰峰值，(q) 細(xì)胞內(nèi)動作電位峰峰值與細(xì)胞外場電位峰峰值的比值，(r) 細(xì)胞內(nèi)動作電位持續(xù)時間，(s) 細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)動作電位搏動頻率。統(tǒng)計圖每組分析n=10或4個數(shù)據(jù)，以均值±sem表示。顯著性差異通過單因素方差分析，，p<0.05；，p<0.01；，p<0.001；，p<0.0001；NS，無統(tǒng)計學(xué)意義。

我們使用自研的電穿孔系統(tǒng)和電生理信號記錄系統(tǒng)連續(xù)記錄心肌細(xì)胞的電生理信號，以觀察微電穿孔后電生理信號的波形演變（圖3f-o）。記錄到的電生理信號顯示出相似的發(fā)展模式：在初始階段，心肌細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生細(xì)胞外場電位。隨著微電穿孔的進行，細(xì)胞外場電位迅速轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)動作電位。細(xì)胞內(nèi)動作電位的幅度衰減到較低水平，最終恢復(fù)到細(xì)胞外場電位的幅度。通過分析這些時期的電生理信號，我們能夠識別微電穿孔前后以及其他關(guān)鍵時刻的電信號特征。例如，如圖3g所示，20微米微電極獲得的電生理信號在微電穿孔后瞬間從幅度為59.04微伏的細(xì)胞外場電位轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)動作電位。細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度從32秒時的127.85微伏逐漸下降到58秒時的81.77微伏。在74秒時，細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度為65.22微伏，其波形開始呈現(xiàn)類似于細(xì)胞外場電位的去極化峰。最終，在158秒時，動作電位波形完全恢復(fù)到幅度為56.88微伏的場電位。

如圖3i所示，50微米微電極獲得的電信號在微電穿孔后瞬間從幅度為75.36微伏的細(xì)胞外場電位轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)動作電位。細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度從37秒時的188.49微伏逐漸下降到47秒時的131.48微伏。然后，在93秒時，細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度為72.80微伏，其波形開始呈現(xiàn)類似于細(xì)胞外場電位的去極化峰。最終，在252秒時，動作電位波形完全恢復(fù)到幅度為78.80微伏的場電位。如圖3k所示，100微米微電極獲得的電信號在微電穿孔后瞬間從幅度為158.57微伏的細(xì)胞外場電位轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)動作電位。細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度從30秒時的346.57微伏逐漸下降到36秒時的251.10微伏。然后，在80秒時，細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度為163.65微伏，其波形開始呈現(xiàn)類似于細(xì)胞外場電位的去極化峰。在178秒時，細(xì)胞內(nèi)動作電位波形完全恢復(fù)到幅度為158.61微伏的細(xì)胞外場電位。

同樣如圖3m所示，200微米微電極獲得的電信號在微電穿孔后瞬間從幅度為307.86微伏的細(xì)胞外場電位轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)動作電位。細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度從33秒時的396.89微伏逐漸下降到52秒時的298.76微伏。然后，在73秒時，細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度為298.76微伏，其波形開始呈現(xiàn)類似于細(xì)胞外場電位的去極化峰。最終，在214秒時，細(xì)胞內(nèi)動作電位波形完全恢復(fù)到幅度為267.91微伏的細(xì)胞外場電位。

同樣如圖3o所示，400微米微電極獲得的電信號在微電穿孔后瞬間從幅度為285.78微伏的細(xì)胞外場電位轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)動作電位。細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度從30秒時的681.79微伏逐漸下降到42秒時的477.45微伏。然后，在85秒時，細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度為216.85微伏，其波形開始呈現(xiàn)類似于細(xì)胞外場電位的去極化峰。最終，在214秒時，細(xì)胞內(nèi)動作電位波形完全恢復(fù)到幅度為253.47微伏的細(xì)胞外場電位。波形演變圖表明，微電極尺寸影響心肌細(xì)胞初始微電穿孔、穩(wěn)定化和重新封閉階段的時間。

為了研究多尺寸微電極陣列中不同尺寸微電極對微電穿孔前后細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位參數(shù)的影響，本研究進行了統(tǒng)計分析。如圖3p所示，隨著微電極尺寸的增加，動作電位峰峰值逐漸增加。特別是，動作電位峰峰值從20微米微電極陣列的61.91±4.83毫伏增加到400微米微電極陣列的217.73±8.72毫伏，增加了約220%。這主要是由于較大尺寸的微電極具有較低的阻抗。在進行微電穿孔時，較大尺寸的電極可能在心肌細(xì)胞中產(chǎn)生較大的穿孔面積。由于場電位峰峰值和動作電位峰峰值隨著微電極尺寸的增加以相似的比例增加，不同尺寸微電極測量的動作電位峰峰值與場電位峰峰值的比值沒有顯著差異（圖3q）。

不同尺寸微電極獲取的細(xì)胞內(nèi)動作電位波形將逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞外場電位波形特征。從微電穿孔開始到出現(xiàn)場電位波形特征之間的時間被定義為動作電位持續(xù)時間。在比較細(xì)胞內(nèi)動作電位的時間依賴性時，隨著微電極尺寸的增加，細(xì)胞內(nèi)動作電位的持續(xù)時間逐漸縮短。細(xì)胞內(nèi)動作電位持續(xù)時間從20微米微電極的67.20±1.49秒減少到400微米微電極的54.55±2.44秒，減少了約17.5%（見圖3r）。此外，研究了多尺寸微電極陣列中不同尺寸微電極對微電穿孔前后搏動頻率的影響。如圖3s所示，在不同尺寸微電極表面，心肌細(xì)胞在微電穿孔前后的搏動頻率沒有顯著差異。由于施加的電壓脈沖頻率可能與心肌細(xì)胞的自調(diào)節(jié)頻率不匹配，因此無法有效驅(qū)動或抑制細(xì)胞活動。

通過觀察不同尺寸微電極記錄的電信號波形隨時間的變化，結(jié)果表明微電極尺寸對電信號的演變有顯著影響。此外，為了深入了解相同尺寸微電極對波形的影響，分別將細(xì)胞外場電位波形和細(xì)胞內(nèi)動作電位波形疊加以便于觀察，并對它們的幅度進行了統(tǒng)計分析（見圖4）。在圖4左側(cè)的波形疊加圖中，在相同微電穿孔條件下，相同尺寸微電極記錄的場電位和動作電位波形高度重合。

圖4. 多尺寸微電極陣列記錄的肌電信號波形和幅度。

a,b 20微米微電極記錄的28個細(xì)胞外場電位和28個細(xì)胞內(nèi)動作電位波形疊加。

c,d 20微米微電極記錄的細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度熱圖。

e,f 50微米微電極記錄的32個細(xì)胞外場電位和32個細(xì)胞內(nèi)動作電位波形疊加。

g,h 50微米微電極記錄的細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度熱圖。

i,j 100微米微電極記錄的28個細(xì)胞外場電位和27個細(xì)胞內(nèi)動作電位波形疊加。

k,l 100微米微電極記錄的細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度熱圖。

m,n 200微米微電極記錄的20個細(xì)胞外場電位和20個細(xì)胞內(nèi)動作電位波形疊加。

o,p 200微米微電極記錄的細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度熱圖。

q,r 400微米微電極記錄的29個細(xì)胞外場電位和29個細(xì)胞內(nèi)動作電位波形疊加。

s,t 400微米微電極記錄的細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位幅度熱圖。

u-x 統(tǒng)計圖：(u) 細(xì)胞外場電位信噪比和細(xì)胞內(nèi)動作電位信噪比，(v) 50%動作電位持續(xù)時間，(w) 單細(xì)胞動作電位信號比例和(x) 動作電位產(chǎn)率。統(tǒng)計圖每組分析n=10或4個數(shù)據(jù)，以均值±sem表示。顯著性差異通過單因素方差分析，，p<0.05；，p<0.01；，p<0.001；，p<0.0001；NS，無統(tǒng)計學(xué)意義。

此外，從不同尺寸微電極記錄了典型的細(xì)胞外場電位和細(xì)胞內(nèi)動作電位，來自不同尺寸微電極記錄的場電位和動作電位信號波形具有相似性。如圖4右側(cè)的幅度熱圖所示，經(jīng)過微電穿孔處理后，細(xì)胞內(nèi)動作電位的幅度普遍高于細(xì)胞外場電位。熱圖還顯示，隨著微電極尺寸的增加，場電位和動作電位的幅度都逐漸增加。例如，20微米微電極記錄的最高電位未超過100微伏，而400微米微電極記錄的最高電位超過500微伏。這可能是因為較大尺寸的微電極可以捕獲更多的電流。此外，較大的微電極尺寸有助于降低微電極與心肌細(xì)胞之間的接觸電阻，從而減少信號衰減。

接下來，統(tǒng)計了不同尺寸微電極記錄的場電位信噪比和動作電位信噪比。如圖4u所示，隨著微電極尺寸的增加，場電位信噪比和動作電位信噪比都逐漸增加。場電位信噪比從20微米微電極的12.43±0.80分貝增加到400微米微電極的23.65±0.90分貝，增加了約90%。動作電位信噪比從20微米微電極的22.39±1.07分貝增加到400微米微電極的26.94±2.00分貝，增加了約20%。這歸因于電極的較低阻抗通常記錄到具有較高信噪比的信號。

同樣如圖4v所示，在相同電壓下進行微電穿孔處理后，歸一化的50%動作電位持續(xù)時間在不同尺寸微電極中同樣沒有顯著差異。在3V電壓下，由于脈沖寬度太窄，脈沖電壓無法提供足夠的電荷來改變細(xì)胞膜電位，導(dǎo)致細(xì)胞的50%動作電位持續(xù)時間沒有變化。結(jié)果表明，在多尺寸微電極陣列中，微電極尺寸對心肌細(xì)胞自調(diào)節(jié)影響不大。此外，高質(zhì)量細(xì)胞內(nèi)動作電位的一個評估標(biāo)準(zhǔn)是來自單個心肌細(xì)胞的動作電位信號比例，理想情況下，每個微電極只記錄一個細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)動作電位。

如圖2d, e所示，當(dāng)兩個心肌細(xì)胞生長在微電極表面時，微電極測量到的細(xì)胞內(nèi)動作電位有兩個峰。將單個尖峰的細(xì)胞內(nèi)動作電位波形的通道數(shù)量與細(xì)胞內(nèi)動作電位總通道數(shù)量的比值定義為單細(xì)胞動作電位信號比例。我們遵循單細(xì)胞信號標(biāo)準(zhǔn)。在多尺寸微電極陣列中統(tǒng)計了單細(xì)胞信號比例，結(jié)果顯示，20微米微電極記錄的單細(xì)胞動作電位信號比例為86.87±1.55%，而400微米微電極僅為57.91±2.53%（見圖4w）。還分析了多尺寸微電極陣列中不同微電極尺寸對細(xì)胞微電穿孔效率的影響。如圖4x所示，隨著微電極尺寸的增加，動作電位產(chǎn)率逐漸降低。動作電位產(chǎn)率從20微米微電極的93.79±2.54%下降到400微米微電極的77.70±1.97%。這是由于微電極尺寸的增加導(dǎo)致與細(xì)胞的有效接觸面積減少，從而降低了細(xì)胞膜區(qū)域的電流密度和電場模量（圖2r-t）。