為了探索微電極尺寸對微電穿孔前后心肌細胞自調(diào)節(jié)的影響，統(tǒng)計了微電穿孔前后的搏動頻率和50%動作電位持續(xù)時間。如圖6e所示，在不同尺寸微電極表面，心肌細胞在微電穿孔前后的搏動頻率沒有觀察到顯著差異。圖6f顯示，在相同電壓下微電穿孔后，從不同尺寸微電極記錄的細胞內(nèi)信號的50%動作電位持續(xù)時間差異很小，大部分在70-90毫秒之間。上述結(jié)果表明，在相同電壓脈沖（3V）作用下，微電極尺寸對心肌細胞自調(diào)節(jié)幾乎沒有影響。

此外，高質(zhì)量細胞內(nèi)動作電位的一個評估標(biāo)準(zhǔn)是來自單個心肌細胞的動作電位信號比例，理想情況下，每個微電極只記錄一個細胞的細胞內(nèi)動作電位。結(jié)果表明，單細胞信號比例隨著微電極尺寸的增加而逐漸降低，從20微米微電極的高達81.32±2.62%到400微米微電極的僅65.44±3.14%（圖6g）。最后，評估了不同尺寸微電極的微電穿孔效率。如圖6h所示，在相同電壓脈沖下，較小尺寸的微電極更容易通過微電穿孔獲得細胞內(nèi)動作電位。結(jié)果表明，動作電位產(chǎn)率隨著微電極尺寸的增加而逐漸降低，從20微米微電極的高達93.28±2.75%下降到400微米微電極的僅75.70±2.58%。

雷達圖總結(jié)了兩種模式下不同尺寸微電極的參數(shù)（圖6i-m）。在相同的微電穿孔條件下，相同尺寸微電極的參數(shù)變化趨勢在兩種類型的制造微電極陣列中大致相同。微電極之間參數(shù)覆蓋面積隨著微電極尺寸的增加而逐漸擴大。在本實驗中，參數(shù)曲線覆蓋的面積越大，微電極的信號捕獲性能越好。微電極陣列不僅能夠探測尺寸對細胞內(nèi)動作電位參數(shù)的影響，而且能夠在多輪中重復(fù)進行。在每一輪中，微電極陣列能夠記錄不同天數(shù)細胞內(nèi)動作電位幅度的變化。圖6n, o中的熱圖揭示了在混合尺寸微電極陣列與多尺寸微電極陣列中，不同微電極尺寸對電信號多個參數(shù)的影響。

熱圖中的顏色尺度可視化了微電極尺寸對心肌細胞內(nèi)動作電位峰峰值、動作電位與場電位峰峰值比值、場電位和動作電位信噪比、動作電位持續(xù)時間、50%動作電位持續(xù)時間、單細胞動作電位信號比例以及細胞內(nèi)動作電位產(chǎn)率的作用。在兩種類型微電極陣列的參數(shù)熱圖中，可以觀察到電信號的幅度和信噪比隨著微電極尺寸的增加而增加，而心肌細胞的動作電位持續(xù)時間和單個心肌細胞動作電位的比例則呈下降趨勢。

由于其高單細胞信號比例和動作電位產(chǎn)率，小尺寸電極更適用于高通量、高分辨率的檢測（圖6n, o紅色區(qū)域）。較大尺寸的微電極可以記錄到幅度更高、信噪比改善的電生理信號。然而，它們的使用伴隨著信號重疊和多細胞信號干擾等挑戰(zhàn)，這可能限制了它們的適用性。因此，大尺寸電極更適合評估來自低密度細胞或大尺寸細胞的電生理信號。本研究也強調(diào)了進一步優(yōu)化的機會。未來，可以通過整合信號解卷積算法或人工智能模型來實現(xiàn)單細胞細胞內(nèi)動作電位的分離，為增強細胞內(nèi)信號記錄的精度鋪平道路（圖6n, o黃色區(qū)域）。

討論

本研究的創(chuàng)新之處在于發(fā)現(xiàn)直徑大于或等于100微米的微電極仍然可以實現(xiàn)高效率且安全的細胞電穿孔。傳統(tǒng)上，增加電極尺寸會損害定位電場的能力，對細胞穿孔效率產(chǎn)生負面影響，并可能通過影響更大面積的細胞膜而損害細胞健康。因此，先前的研究集中于開發(fā)直徑在100納米到10微米之間的微納米電極用于細胞穿孔和信號記錄。然而，這些電極需要復(fù)雜的微納米制造技術(shù)，限制了它們的生產(chǎn)。在本研究中，我們首次證明直徑超過100微米的微電極不僅保持了高穿孔效率和高安全性，而且在記錄細胞內(nèi)信號方面表現(xiàn)出強大的性能。

這一發(fā)現(xiàn)顯著擴展了微電極制造的靈活性。較大的電極，例如超過100微米的電極，可以不依賴于復(fù)雜的光刻微加工來制造。相反，替代制造方法，包括激光加工、絲網(wǎng)印刷或基于掩模的磁控濺射，可以快速制造此類電極。例如，基于石墨烯的、直徑為100微米的微電極陣列可以使用這些技術(shù)高效制備。發(fā)現(xiàn)這些較大電極具有優(yōu)異的細胞穿孔效率和細胞內(nèi)信號記錄能力，為推進微電極陣列的發(fā)展提供了寶貴的見解，使其成為細胞內(nèi)信號記錄應(yīng)用的有前景工具。

結(jié)論

在本研究中，我們通過開發(fā)具有多種微電極尺寸的微電極陣列并結(jié)合微電穿孔技術(shù)，成功記錄了細胞內(nèi)動作電位，進一步研究了微電極尺寸對心肌細胞內(nèi)動作電位記錄的影響。首先，通過三維COMSOL模型和等效電路模型模擬，驗證了結(jié)合微電穿孔技術(shù)的微電極進行細胞內(nèi)動作電位記錄的可行性。隨后，使用標(biāo)準(zhǔn)光刻工藝制造了具有多種電極尺寸的微電極陣列。結(jié)果表明，微電穿孔技術(shù)可以應(yīng)用于不同尺寸的微電極以實現(xiàn)細胞內(nèi)動作電位記錄，而不僅限于高分辨率微電極。

此外，從較大尺寸微電極獲得的電信號的幅度、幅度比和信噪比更高。盡管如此，隨著微電極尺寸的增加，微電穿孔的有效性和記錄到的單細胞信號比例降低。因此，較小的微電極尺寸更適合記錄緊密連接細胞的細胞內(nèi)動作電位，而較大的微電極尺寸更適合記錄分散細胞的細胞內(nèi)動作電位，因為較大的微電極尺寸有利于增加分散細胞細胞內(nèi)動作電位的獲取概率。本研究探索的結(jié)果為從較大尺寸微電極記錄細胞內(nèi)動作電位鋪平了道路，并為使用其他低成本制造技術(shù)制造用于高質(zhì)量細胞內(nèi)動作電位記錄的微電極提供了新的機會。

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