表觀總消化率：

為了測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀總消化率，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)期的第18天至第22天，進(jìn)行了4次24小時(shí)的尿液和糞便收集。母牛被飼養(yǎng)在單獨(dú)的收集欄中，并安裝了留置導(dǎo)尿球囊。糞便收集在放置在每頭小母牛身后的盤子里。每天從每頭小母牛身上采集10%的糞便子樣，并按期內(nèi)小母牛進(jìn)行合成。將具有代表性的樣本（500克）在55℃下干燥96小時(shí)，以測(cè)定DM。尿液收集在預(yù)裝4NH2SO4（500mL）的密閉收集容器中，以防止NH3-N的揮發(fā)。每天采集一份2%的酸化尿樣，然后按母牛的周期進(jìn)行合成。尿液子樣以1:5的比例用蒸餾水稀釋，并儲(chǔ)存在-20℃溫度下，直至分析。

血液采樣：

第22天，在飼喂前和飼喂后6小時(shí)從母牛頸靜脈采集血樣。采血時(shí)使用兩個(gè)10mL含肝素鋰的真空管，用于血漿尿素氮（PUN）分析。試管在4℃溫度下以2,000×g離心20分鐘，然后將血漿轉(zhuǎn)移到微管中，在-20℃溫度下冷凍，直至分析。

反芻動(dòng)物pH值記錄儀：

第25天，將pH記錄器放入每頭母牛的腹腔，以測(cè)定瘤胃pH值。使用LRC pH數(shù)據(jù)記錄器系統(tǒng)記錄瘤胃pH值，從第25天到第27天，每隔1分鐘記錄一次。記錄儀在使用前后使用pH4和pH7緩沖液進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化處理。

箱體測(cè)量：

為了測(cè)量CH4排放量，將母牛分別飼養(yǎng)在4個(gè)開(kāi)放式呼吸室（寬4.4m×深3.7m×高3.9m，容積63.5m3 MB）中。第26天，母牛被轉(zhuǎn)移到受控環(huán)境建筑物中，并被帶入分配給它們的飼養(yǎng)室，在那里立即喂食，并關(guān)閉飼養(yǎng)室的門。母牛在小室中飼養(yǎng)3次，每次24小時(shí)，每天打開(kāi)小室一次，以便喂食和清潔。Beauchemin和McGinn對(duì)方法和排放計(jì)算進(jìn)行了詳細(xì)描述。在研究開(kāi)始之前和之后，都對(duì)樣品室進(jìn)行了校準(zhǔn)，并每天對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。不同樣品室的斜率差異小于5%，回收率在98%到106%之間。

化學(xué)分析和計(jì)算：

飼料、飼料殘?jiān)图S便樣品在55℃下烘干，以測(cè)定DM，然后通過(guò)1mm篩磨。對(duì)樣品進(jìn)行分析，以測(cè)定DM方法、OM、灰分、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）。灰分含量通過(guò)在馬弗爐中于550℃下燃燒5小時(shí)測(cè)定。樣品按順序進(jìn)行NDF和ADF分析方法，并對(duì)纖維分析儀進(jìn)行修改，在NDF分析程序中加入熱穩(wěn)定的α淀粉酶和亞硫酸鈉，NDF表示不包括殘留灰分。

為了測(cè)定淀粉和氮的含量，將干飼料和糞便的子樣品在球磨機(jī)中研磨。飼料、拒食飼料、糞便和尿液中的氮采用閃燃?xì)庀嗌V法和熱導(dǎo)檢測(cè)法定量。粗蛋白（CP）以N×6.25計(jì)算。淀粉的測(cè)定方法如下Herrera-Saldana等人。使用淀粉葡萄糖苷酶和1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶的混合物水解α-葡萄糖聚合物。葡萄糖樣品的吸光度在Thermo Scientific Appliskan1.437微孔板閱讀器上以490納米的波長(zhǎng)讀取。飼料和糞便樣品的總能量含量用炸彈熱量計(jì)測(cè)定。

溶解的H2是用氫氣電極（H2-500；Unisense，丹麥奧胡斯）測(cè)量的，電極連接在一個(gè)玻璃流通池（內(nèi)徑2毫米，外徑6毫米）上。H2電極與微型傳感器萬(wàn)用表（Unisense，丹麥奧胡斯）相連。傳感器的校準(zhǔn)方法與Guyader等人所述相同。按照Dehority的描述，使用深度為1毫米的Levy-Hausser計(jì)數(shù)室在光學(xué)顯微鏡下對(duì)原生動(dòng)物進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用氣相色譜儀測(cè)定瘤胃中的揮發(fā)性脂肪酸，氣相色譜儀配有30米長(zhǎng)的Zebron游離脂肪酸相熔融石英毛細(xì)管，內(nèi)徑0.32毫米，膜厚1.0微米。

NH3-N的濃度是按照Broderick和Kang所述的次氯酸苯酚法測(cè)定的。血漿中尿素氮的濃度是用微分流量分析儀，尿囊素的測(cè)定方法由Young和Conway描述，尿酸濃度的測(cè)定方法是使用商業(yè)試劑盒。

微生物氮合成量的估算采用了Chen和Gomes提出的計(jì)算方法：

其中，嘌呤衍生物總量（PD）是尿囊素和尿酸排泄量的總和（毫摩爾/天）。微生物流量（克N/天）的計(jì)算公式為：

制熱量（HP）是根據(jù)Brouwer提出的公式，利用3天試驗(yàn)室測(cè)量中消耗的氧氣以及產(chǎn)生的甲烷和二氧化碳（CO2）的平均值計(jì)算得出的：

瘤胃微生物群落：

只有使用對(duì)照組或2.0%EB處理的母牛樣品才用于微生物分析。樣品經(jīng)冷凍干燥后用咖啡研磨機(jī)研磨。使用Zymobiomics DNA提取試劑盒從0.1克冷凍干燥研磨樣品中提取DNA。通過(guò)使用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)量260/280和260/230吸光度的比率，確定提取的元基因組DNA的濃度和純度。使用引物27F和1398R進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增全長(zhǎng)16srRNA基因，以確認(rèn)樣品中不存在PCR抑制劑。

測(cè)序工作在麥吉爾大學(xué)和魁北克基因組創(chuàng)新中心進(jìn)行，使用的是Illumina MiSeq Reagent Kit v2，遵循了制造商的指導(dǎo)原則。515F引物和806R引物靶向16srRNA基因的V4區(qū)域，用于檢測(cè)細(xì)菌和古細(xì)菌的多樣性。使用1μL1比10稀釋的基因組DNA和快速啟動(dòng)高保真PCR系統(tǒng)進(jìn)行33個(gè)循環(huán)的PCR，條件如下：94℃2分鐘，然后進(jìn)行33個(gè)循環(huán)：94℃30秒，58℃30秒，72℃0秒，最后在72℃7分鐘進(jìn)行延伸。使用FastStart高保真PCR系統(tǒng)在以下條件下將Fluidigm公司的條形碼納入第二個(gè)PCR反應(yīng)：95℃10分鐘，然后進(jìn)行15個(gè)循環(huán)：95℃15秒，60℃30秒，72℃1分鐘，最后在72℃下延伸3分鐘。擴(kuò)增后，在2%瓊脂糖凝膠中評(píng)估PCR產(chǎn)物，以確認(rèn)擴(kuò)增是否充分。所有樣本均使用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析試劑盒進(jìn)行量化，并按等比例匯集。然后使用校準(zhǔn)過(guò)的Ampure XP珠子對(duì)匯集的樣本進(jìn)行純化。使用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析試劑盒和Kapa Illumina GA with Revised Primers-SYBR Fast Universal試劑盒對(duì)匯集的樣本（文庫(kù)）進(jìn)行量化。使用LabChip GX儀器測(cè)定平均片段大小。

將原始fastq文件導(dǎo)入Qiime2進(jìn)行序列分析。使用插件cutadapt從序列文件中移除引物和適配器序列。移除引物和適配序列后，使用程序dada2進(jìn)行質(zhì)量控制，過(guò)濾測(cè)序數(shù)據(jù)中的任何phiX讀數(shù)，并移除嵌合序列。Dada2模型用于糾正Illumina序列數(shù)據(jù)中的錯(cuò)誤，并生成一個(gè)包含菌株級(jí)分辨率序列計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)（豐度）的特征表。在Dada2之后，使用Mafft程序進(jìn)行多序列比對(duì)，并屏蔽高變異區(qū)域。用FastTree生成系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。使用使用Silva128參考數(shù)據(jù)庫(kù)和特征分類器插件訓(xùn)練的樸素貝葉斯分類器將分類分配給序列。為確保α和β多樣性分析使用相同數(shù)量的序列，對(duì)所有樣本中的最低序列數(shù)進(jìn)行了子采樣。多樣性插件core-diversity-metrics用于評(píng)估樣本內(nèi)部（α-多樣性）和樣本之間（β-多樣性）的微生物多樣性。對(duì)α-多樣性、系統(tǒng)發(fā)育多樣性、觀察到的OTU數(shù)量、均勻度和分類豐度進(jìn)行了評(píng)估。使用加權(quán)和非加權(quán)UniFrac進(jìn)行了β-多樣性分析。序列已存入Small Reads Archive，登錄號(hào)為PRJNA534330。

統(tǒng)計(jì)分析：

數(shù)據(jù)使用SAS的MIXED模型程序進(jìn)行分析。單變量程序用于驗(yàn)證數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析前，對(duì)原生動(dòng)物計(jì)數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)10轉(zhuǎn)換，以符合方差均一性。所有變量的數(shù)據(jù)均以小母牛為實(shí)驗(yàn)單位進(jìn)行分析，但CH4測(cè)量除外，因?yàn)槊款^小母牛在每個(gè)時(shí)期都飼養(yǎng)在同一試驗(yàn)室內(nèi)，所以試驗(yàn)室內(nèi)的小母牛為實(shí)驗(yàn)單位。該模型包括EB作為固定效應(yīng)，以及方形、方形內(nèi)嵌套的小母牛和方形內(nèi)嵌套的時(shí)期等隨機(jī)效應(yīng)。在微生物分析中，還包括來(lái)源（LAM、SAM、FAM）的固定效應(yīng)以及處理與來(lái)源的交互作用。對(duì)于瘤胃變量和血液參數(shù)，小時(shí)被視為重復(fù)測(cè)量，對(duì)于瘤胃室和pH值記錄儀測(cè)量，日被視為重復(fù)測(cè)量。使用SAS對(duì)連續(xù)的瘤胃pH數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)，包括日平均值、最小值、最大值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。在每個(gè)時(shí)期的4天內(nèi)，計(jì)算每個(gè)試驗(yàn)室每天的累計(jì)CH4排放量。使用Akaike信息標(biāo)準(zhǔn)的最小值來(lái)選擇適當(dāng)?shù)膮f(xié)方差結(jié)構(gòu)。使用Tukey檢驗(yàn)計(jì)算經(jīng)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正的P值。當(dāng)P<0.05時(shí)，宣布平均值之間存在差異，并使用對(duì)比聲明來(lái)檢驗(yàn)線性和二次效應(yīng)，系數(shù)根據(jù)非等距處理結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整。弦線圖使用R Studio中的circlize軟件包生成。

結(jié)果:

表3：飼喂以大麥青貯料為基礎(chǔ)日糧的小母牛的干物質(zhì)采食量和瘤胃發(fā)酵產(chǎn)物，其中大麥青貯料日糧含有增加添加的強(qiáng)化生物炭

各處理的干物質(zhì)攝入量和總VFA濃度相似（P>0.21；表3）。飼喂0.5%和2.0%EB的母牛體內(nèi)的乙酸濃度（P=0.01）高于飼喂1.0%EB的母牛。隨著EB處理量的增加，異丁酸濃度和溶解的H2呈二次方下降趨勢(shì)（P=0.09）。氨氮濃度呈二次方趨勢(shì)（P=0.01），0.5%EB最初會(huì)降低NH3-N濃度，但對(duì)照組與1.0%和2.0%EB之間沒(méi)有差異。

表4：飼喂以大麥青貯料為基礎(chǔ)日糧，增加添加強(qiáng)化生物炭的小母牛原生動(dòng)物數(shù)量和瘤胃pH

原生動(dòng)物總計(jì)數(shù)呈二次下降（P<0.01），對(duì)照組的總計(jì)數(shù)高于所有濃度的EB（表4）。不同處理中Entodinium、Holotrichs和其他原生動(dòng)物屬的百分比沒(méi)有差異（P>0.14）。當(dāng)EB增加2.0%時(shí)，pH值的最小值和變化值呈二次方趨勢(shì)（P<0.06）,最小的pH值和減少的pH值變化。