摘要：

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤。分子氫被認(rèn)為是包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的預(yù)防和治療氣體。在我們的研究中，我們試圖評估分子氫對GBM的潛在作用。使用大鼠正位膠質(zhì)瘤模型和小鼠皮下異種移植模型進(jìn)行體內(nèi)研究。動物每天吸入氫氣（67%）1小時，共兩次。核磁共振成像研究用于確定腫瘤體積。通過免疫組織化學(xué)（IHC）、免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析來確定表面標(biāo)記物的表達(dá)。進(jìn)行球形成試驗以評估癌癥干細(xì)胞的自我更新能力。還進(jìn)行了細(xì)胞遷移、侵襲和集落形成試驗。體內(nèi)研究表明，吸入氫氣能有效抑制GBM腫瘤的生長，延長GBM小鼠的生存期。IHC和免疫熒光染色表明，氫氣處理可明顯下調(diào)干性（CD133、Nestin）、增殖（ki67）和血管生成（CD34）標(biāo)志物的表達(dá)，同時還可上調(diào)分化標(biāo)志物GFAP的表達(dá)。體外研究也得到了類似的結(jié)果。氫處理還抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的成球能力。此外，氫處理還抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和集落形成能力。這些結(jié)果表明，分子氫可作為一種潛在的抗腫瘤藥物，用于治療腦膠質(zhì)瘤。

引言：

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤，其特點是增殖迅速、向正常腦組織擴(kuò)散性侵襲、化療抵抗力強(qiáng)。目前治療GBM的標(biāo)準(zhǔn)方法是最大限度切除腫瘤，然后進(jìn)行放療，并同時輔助替莫唑胺。GBM的侵襲性是根治性治療的主要障礙，因為它使手術(shù)完全切除成為不可能，并導(dǎo)致治療后腫瘤復(fù)發(fā)。盡管多年來一直在研究GBM的潛在新療法，但目前的治療策略仍不足以控制病情，1年相對生存率為37.4%，5年生存率為4.9%。因此，開發(fā)治療GBM的新方法尤為重要。

自O(shè)hsawa等人報道吸入1-4%的氫氣可明顯縮小大鼠腦梗塞的大小以來，分子氫就被認(rèn)為是一種預(yù)防和治療性醫(yī)用氣體。目前，已有170多種不同的人類和動物疾病模型證明了氫的潛在益處。最近，分子氫對癌癥的影響引起了人們的極大關(guān)注。1975年，Dole等人在《科學(xué)》雜志上首次報道了氫氣對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療作用。他們發(fā)現(xiàn)，在總壓為8個大氣壓的條件下，用97.5%的氫氣對小鼠進(jìn)行為期2周的高壓氧治療，可明顯誘導(dǎo)腫瘤消退。由于高壓氫氣治療的特殊條件，隨后關(guān)于氫氣抗癌作用的研究一直停滯不前，直到2007年Ohsawa等人報道了低濃度氫氣的生物效應(yīng)。幾年后，Saitoh等人報道了中性pH值的富氫電解水（NHE水）可在體外細(xì)胞模型中達(dá)到抑制腫瘤生長和腫瘤侵襲的效果。隨后的體外研究表明，分子氫可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和集落形成，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。一些體內(nèi)研究表明，分子氫可以防止癌變，抑制癌癥進(jìn)展，減輕化療或放療的副作用，增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤作用。雖然分子氫已在癌癥治療領(lǐng)域顯示出潛力，但其抗癌特性僅限于少數(shù)幾種腫瘤類型，其潛在的分子機(jī)制仍有待確定。

在本研究中，我們探討了分子氫對GBM的可能治療作用。我們使用體內(nèi)和體外實驗?zāi)Ｐ蛠碓u估分子氫的潛在作用。我們還研究了氫氣作用的機(jī)制。

材料與方法：

動物和腫瘤細(xì)胞系：

雄性Wistar大鼠（8周齡，體重170-180克）和雌性BALB/c裸鼠（8周齡，體重20-24克）。動物飼養(yǎng)在22°C-25°C、12小時光-暗周期的標(biāo)準(zhǔn)條件下，以正常飲食喂養(yǎng)。

大鼠C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞和人類U87細(xì)胞來自美國類型細(xì)胞收集中心。細(xì)胞在5%CO2和37°C的DMEM/F12培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素。

大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型：

實驗前大鼠禁食1天。然后腹腔注射10%水合氯醛（3mL/kg）進(jìn)行麻醉，并固定在立體定向裝置中。然后用手術(shù)剪在顱骨中線切開頭皮皮膚。然后，在顱骨前囟門后1毫米、矢狀縫外側(cè)3毫米處開孔。將帶有微型注射器的30號針頭插入距顱骨表面7毫米的深度，立體注射10μL磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞（1×106）。注射過程持續(xù)10分鐘，然后將針頭固定在原位5分鐘，再逐漸抽出3分鐘，以防止溶液倒流。植入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，大鼠被隨機(jī)分為兩組，包括氫氣吸入組（HI）和對照組（CTRL）。

小鼠U87皮下模型：

BALB/c裸鼠皮下注射1×106個存活的U87細(xì)胞。注射后，小鼠被隨機(jī)分為兩組，包括氫氣吸入組（HI）和對照組（CTRL）。腫瘤體積每周測量一次，計算公式如下：體積=寬度2×長度×0.4。

吸入氫氣：

將一個透明的密閉箱（20cm×18cm×15cm）連接到氫氧霧化器，該霧化器產(chǎn)生67%的H2和33%的O2（V/V）。在大鼠C6膠質(zhì)瘤或小鼠U87皮下模型建立的第二天開始進(jìn)行氫氣處理，直至實驗結(jié)束。將小鼠置于氫氣箱中，每天吸入混合氣體兩次，每次1小時。在吸入過程中，小鼠保持清醒并自由活動。使用熱痕量GC超氣相色譜法監(jiān)測封閉箱中的氫氣濃度。