TLR4激活被發(fā)現(xiàn)參與高葡萄糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞過度增殖

蛋白質(zhì)印跡顯示，高葡萄糖（25 mM）孵育顯著激活了TLR4的表達(dá)（圖1D）。通過siRNA下調(diào)TLR4可以逆轉(zhuǎn)小鼠系膜細(xì)胞的過度增殖（圖2C）。有趣的是，敲低CSE也顯著增加了小鼠系膜細(xì)胞中的TLR4表達(dá)（圖2B）；NaHS處理可以顯著抑制TLR4激活并抑制細(xì)胞過度增殖（圖2B）。此外，TLR4下調(diào)并未顯著改變高葡萄糖誘導(dǎo)的CSE表達(dá)抑制（圖2A）。然而，TLR4沉默可以顯著消除由CSE下調(diào)引起的細(xì)胞過度增殖。這些結(jié)果暗示在由高血糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞過度增殖通路中，TLR4可能位于CSE通路的下游。

圖2. CSE抑制誘導(dǎo)的TLR4激活可能參與HG導(dǎo)致的系膜細(xì)胞過度增殖

(A) TLR4抑制未改變高葡萄糖處理的小鼠系膜細(xì)胞中CSE的表達(dá)（數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖+對照siRNA；n = 4）。

(B) CSE抑制導(dǎo)致TLR4激活，而NaHS處理可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象（數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；*P < 0.05 vs. 對照siRNA；#P < 0.05 vs. CSE siRNA；n = 4）。

(C) TLR4沉默顯著逆轉(zhuǎn)HG誘導(dǎo)的細(xì)胞過度增殖（數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；P < 0.05，*P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖+對照siRNA；##P < 0.01 vs. 25 mM葡萄糖+對照siRNA；n = 4）。

(D) TLR4抑制顯著抑制CSE沉默誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞過度增殖（數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖+對照siRNA，##P < 0.01 vs. 25 mM葡萄糖+對照siRNA；n = 4）。

我們接著研究了TLR4對系膜細(xì)胞中PI3K-Akt通路的影響。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，高血糖顯著增強了PI3K和Akt的磷酸化，在TLR4敲低后恢復(fù)到正常水平，盡管PI3K和Akt的總表達(dá)保持不變（圖3A和B）。如圖3C所示，通過LY294002抑制PI3K也顯著減輕了高葡萄糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。

圖3. PI3K通路抑制以TLR4依賴性方式顯著抑制HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖

(A, B) HG導(dǎo)致小鼠系膜細(xì)胞PI3K/Akt表達(dá)顯著增加，而TLR4沉默可下調(diào)這一表達(dá)（數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖+對照siRNA，##P < 0.01 vs. 25 mM葡萄糖+對照siRNA；n = 4）。

(C) PI3K抑制顯著抑制HG處理誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞過度增殖（數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；P < 0.01 vs. 5 mM葡萄糖；##P < 0.01 vs. 25 mM葡萄糖；n = 4）。

下調(diào)TLR4抑制PI3K-Akt通路并抑制小鼠系膜細(xì)胞過度增殖

討論

本文的主要發(fā)現(xiàn)是，糖尿病腎損傷可能是由硫化氫的下調(diào)誘導(dǎo)的，這種下調(diào)依賴于TLR4表達(dá)增強和H?S合成減少。此外，TLR4介導(dǎo)的PI3K-Akt通路激活部分促進(jìn)了糖尿病腎病的病理生理。

幾個世紀(jì)以來，硫化氫（H?S）一直被認(rèn)為具有高度毒性。然而，最近H?S已被認(rèn)為是介導(dǎo)廣泛生理效應(yīng)的物質(zhì)。一氧化氮（NO）是一種具有生物學(xué)和調(diào)節(jié)特性且半衰期很短（幾秒）的氣體，其特性與H?S相似。與NO一樣，H?S的合成和生物利用度對生理和病理生理過程至關(guān)重要。H?S是一種高親脂性分子，能夠通過擴散自由穿透所有類型細(xì)胞的膜，不需要專門的膜轉(zhuǎn)運蛋白。通過其存在和酶促產(chǎn)生，H?S作為重要的氣體遞質(zhì)，如一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO），因其信號傳導(dǎo)能力而受到關(guān)注。

越來越多的證據(jù)表明，H?S的上調(diào)對糖尿病引起的損傷（如心臟纖維化、腎小球足細(xì)胞損傷、傷口愈合障礙等）發(fā)揮保護(hù)作用。此外，硫化氫（H?S）的減少被認(rèn)為在糖尿病血管并發(fā)癥（包括糖尿病腎?。┲衅痍P(guān)鍵作用。研究表明，較低的H?S濃度是糖尿病腎病發(fā)生和發(fā)展的原因。在伴有腎病的2型糖尿病中，H?S生成與CSE/CBS mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。糖尿病相關(guān)腎病中存在紊亂的H?S代謝。此外，據(jù)報道H?S對認(rèn)知疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用。H?S保護(hù)作用的潛在機制涉及氧化應(yīng)激和自噬。

糖尿病腎病是世界范圍內(nèi)終末期腎病的主要原因。顯著的系膜基質(zhì)擴張是糖尿病患者腎臟病變的特征。不僅是系膜細(xì)胞，上調(diào)的硫化氫也能減輕高葡萄糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞（MPC）損傷。然而，H?S發(fā)揮其多種作用的確切機制和通路尚未完全闡明。我們的研究結(jié)果表明，通過添加外源性供體（NaHS）或過表達(dá)CSE/CBS，上調(diào)H?S可以抑制小鼠系膜細(xì)胞的過度增殖。

TLR是病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）受體家族之一，是具有胞質(zhì)尾部的完整膜糖蛋白，在病原微生物的早期識別和宿主防御中發(fā)揮作用。TLR-4也識別其他配體。與其他TLR一樣，TLR-4能夠識別內(nèi)毒素（LPS）和微生物分子（糖脂、呼吸道合胞病毒融合蛋白和熱休克蛋白）以及內(nèi)源性損傷誘導(dǎo)的組織分子，從而產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號響應(yīng)。值得注意的是，高血糖被證明可誘導(dǎo)TLR4表達(dá)。Pahwa等人發(fā)現(xiàn)TLR4介導(dǎo)高血糖誘導(dǎo)的大血管主動脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和內(nèi)皮糖萼的擾動。高血糖也能在糖尿病視網(wǎng)膜病變的內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)并激活TLR4。本研究證明TLR4敲低抑制了由高血糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞異常增殖，這與其他人的報道一致。

有趣的是，TLR4被報道與H?S合成和生物利用度相關(guān)。Tamizhselvi等人報道H?S可能通過P物質(zhì)上調(diào)TLR4通路。與此一致，我們的體外實驗表明，下調(diào)H?S能顯著激活小鼠系膜細(xì)胞中的TLR4表達(dá)。反之，據(jù)報道在大鼠中TLR4通過NF-κB激活上調(diào)CBS表達(dá)。Zheng等人發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，TLR4基因敲除小鼠顯示出H?S合成酶CSE的表達(dá)升高，從而消除了脂多糖的炎癥效應(yīng)。

磷酸肌醇-4,5-二磷酸3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路在糖尿病中被抑制。我們的結(jié)果表明，干擾TLR4抑制了PI3K/Akt通路，減輕了異常的系膜細(xì)胞增殖。本研究證明H?S對高血糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖的保護(hù)作用可能與下調(diào)PI3K/Akt信號通路有關(guān)。更多證據(jù)表明PI3K/Akt信號通路參與了H?S的生理效應(yīng)。

總之，我們發(fā)現(xiàn)HG抑制內(nèi)源性H?S合成并誘導(dǎo)小鼠系膜細(xì)胞過度增殖；TLR4激活參與HG誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞過度增殖；下調(diào)TLR4抑制PI3K-Akt通路并抑制小鼠系膜細(xì)胞過度增殖。結(jié)論是，高葡萄糖可以通過TLR4依賴性方式抑制硫化氫合成誘導(dǎo)小鼠系膜細(xì)胞過度增殖。