8.Hm保護(hù)細(xì)胞免受輻射損傷

圖5：6Gy輻射24小時(shí)后，氫氣保護(hù)IEC-6細(xì)胞免受輻射誘導(dǎo)的損傷。(A)6Gy輻射24小時(shí)后IEC-6細(xì)胞的相位對(duì)比圖像。(B)輻射6Gy后24小時(shí)死亡細(xì)胞Hoechst染色的代表性顯微照片。(C）輻射6Gy后24小時(shí)，壞死細(xì)胞PI染色的代表性顯微照片。(D)用附件素V-PI染色細(xì)胞，并用流式細(xì)胞術(shù)分析6Gy劑量輻射后24小時(shí)的細(xì)胞，凋亡細(xì)胞的直方圖以占總細(xì)胞的百分比表示。(E）細(xì)胞存活率直方圖以各組的OD值。

相位對(duì)比圖像顯示，輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞縮小了，而氫氣處理阻止了這種變化（圖5A）。此外，我們還使用了兩種方法來(lái)證實(shí)氫氣也能防止細(xì)胞損傷：Hoechst（死亡細(xì)胞）和PI染色（壞死細(xì)胞）。此外，我們還通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行了定量評(píng)估。與Rc組相比，Rh組的IEC-6細(xì)胞凋亡率降低了兩倍（圖5D）。此外，我們還測(cè)量了細(xì)胞存活率，并證實(shí)Hm處理可保護(hù)細(xì)胞存活率（圖5E）。

9.Hm對(duì)6Gy輻射后線粒體凋亡途徑的影響

圖6：氫氣緩解線粒體去極化并調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑。(A）用JC-1染色I(xiàn)EC-6細(xì)胞，并用熒光顯微鏡測(cè)定線粒體膜電位的變化。此外，在給予6Gy輻射30分鐘后，用流式細(xì)胞儀量化紅/綠熒光密度比。B)在6Gy輻射處理后6小時(shí)，對(duì)線粒體（Mito）和細(xì)胞質(zhì)（Cyto）中的細(xì)胞色素c（CytC）進(jìn)行Western印跡分析。(C)在6Gy輻射后6小時(shí)，對(duì)裂解的caspase-9、裂解的caspase-3和RARP進(jìn)行Western印跡分析。(D)在接受6Gy輻射6小時(shí)后，還對(duì)Bax、Bcl-2和Bcl-xl進(jìn)行了Western印跡分析。

還通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位（MMP），探討了氫氣對(duì)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。與S組相比，受到輻射刺激的細(xì)胞顯示出更高水平的綠色熒光強(qiáng)度和更低水平的紅色熒光強(qiáng)度，這表明輻射照射后MMP明顯降低。然而，用Hm處理明顯阻止了MMP的下降（圖6A）。

線粒體凋亡途徑包括細(xì)胞色素c的釋放以及caspase-9、caspase-3和PARP的活性。在我們目前的研究中，輻射導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中（圖6B），隨后caspase-9、caspase-3和PARP被激活（圖6C）。然而，Hm的存在明顯阻止了這些變化。

討論：

在本研究中，我們證實(shí)：(1)氫氣處理減輕了暴露于WR的小鼠的腸道損傷并改善了腸道功能；(2)氫氣處理抑制了暴露于WR的小鼠的氧化應(yīng)激損傷和全身炎癥反應(yīng)；(3)氫氣處理抑制了暴露于WR的小鼠的細(xì)胞凋亡并維持了腸上皮細(xì)胞的增殖；(4)氫氣處理可防止IEC-6細(xì)胞在6Gy輻射劑量下形成ROS；(5)氫氣處理可保護(hù)IEC-6細(xì)胞免受輻射引起的損傷；(6)氫氣處理可緩解IEC-6細(xì)胞在6Gy輻射劑量下的線粒體去極化并阻斷線粒體凋亡途徑。

RT引起的腸道損傷是癌癥患者面臨的一個(gè)重要臨床問(wèn)題。RT的目標(biāo)是在對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生最大毒性的同時(shí)，限制對(duì)周圍正常組織的傷害?？茖W(xué)家們不斷尋找新的、高效且無(wú)毒的藥物，包括用于放射保護(hù)的抗氧化劑。目前，大量數(shù)據(jù)表明，氫氣可選擇性地還原-OH，從而有效保護(hù)組織免受氧化損傷。與其他抗氧化劑相比，氫氣有幾個(gè)獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：(1)它的副作用最小，因?yàn)樗嬖谟谌梭w和大氣中；(2)它性質(zhì)溫和，不會(huì)干擾新陳代謝的氧化還原反應(yīng)，也不會(huì)破壞參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的ROS；(3)它的分子量最小，能輕易穿透細(xì)胞膜，靶向細(xì)胞器，包括線粒體和細(xì)胞核。由于這些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，氫氣具有理想的輻射防護(hù)特性，此前已有多部著作描述了氫氣對(duì)輻射引起的器官損傷以及心肌、胃腸道和造血干細(xì)胞的保護(hù)作用。

腸粘膜是易受輻射損傷的組織。輻照后，腸粘膜壞死會(huì)導(dǎo)致進(jìn)食障礙、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良，危重者甚至死亡。目前的研究表明，氫氣有助于維持腸粘膜的完整性，降低DAO和iFABP的水平，而DAO和iFABP都是腸粘膜損傷的敏感標(biāo)志物（圖2D和E）。此外，氫氣處理還能增加小鼠的進(jìn)食量和體重，并最終減少小鼠的死亡，表明氫氣可能對(duì)輻射引起的腸道損傷有保護(hù)作用（圖1B、C和D）。同樣，XiaoHW等人在2018年證明，口服灌胃氫水可增加食物攝入量和存活率，維持腸黏膜的完整性，從而改善輻射誘導(dǎo)的胃腸毒性。除了抗氧化能力，作者還重點(diǎn)研究了氫氣對(duì)腸道微生物群的影響。

有報(bào)道稱，氫氣可減少心肌和造血干細(xì)胞在WR后的氧化應(yīng)激損傷。輻射過(guò)程中產(chǎn)生的ROS暴發(fā)在輻射引起的腸道損傷的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)表明，氫氣可降低脂質(zhì)過(guò)氧化標(biāo)志物MDA的水平，減少由-OH引起的DNA氧化的主要產(chǎn)物之一8-OHdG，提高細(xì)胞內(nèi)源性重要抗氧化酶SOD的活性，抑制中性粒細(xì)胞聚集指標(biāo)MPO的活性（圖3A、B和F），從而部分恢復(fù)了相對(duì)較低的抗氧化能力，緩解了氧化/還原平衡的破壞。我們將這種利用外源性氫處理來(lái)減少氧化和還原失衡的細(xì)胞保護(hù)新方法稱為"氫復(fù)蘇"。

腸道輻射損傷引起的腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)將導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。在我們目前的研究中，氫氣的輸送也抑制了血清中TNF-α和IL-6水平的升高，這表明氫氣在一定程度上阻止了系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的發(fā)生（圖3C-E）。

科學(xué)家們已經(jīng)證明，細(xì)胞過(guò)度凋亡是導(dǎo)致RT引起的消化道綜合征的主要病因之一。在本研究中，我們證明氫氣可減少小鼠暴露于致死劑量為10Gy的WR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。腸隱窩增殖可促進(jìn)細(xì)胞向上遷移，并產(chǎn)生填充絨毛的終末分化細(xì)胞，這些作用必須發(fā)生才能使腸粘膜從損傷中恢復(fù)。在我們的研究中，雖然輻射導(dǎo)致細(xì)胞增殖率急劇下降，但氫處理卻能維持細(xì)胞增殖，這可能會(huì)促進(jìn)腸粘膜從輻射引起的損傷中恢復(fù)過(guò)來(lái)（圖2A-C）。

在體外實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了常用于研究輻射引起的腸道損傷的IEC-6細(xì)胞系，以研究氫氣的保護(hù)作用及其內(nèi)在機(jī)制。在體內(nèi)，由于ROS的高反應(yīng)性和短半衰期，很難捕獲和測(cè)量ROS。在本研究中，我們使用了兩種經(jīng)典的熒光探針（DCFH-DA和DHE）來(lái)研究氫氣對(duì)輻射誘導(dǎo)的ROS在體外形成的影響。我們的研究表明，氫氣處理能顯著抑制ROS的激增（圖4A-C），這可能是氫氣防輻射的基本作用機(jī)制。

這些結(jié)果與Zhang等人的研究結(jié)果一致，他們證明富氫培養(yǎng)基可降低體外4GyIR劑量下骨髓細(xì)胞的ROS水平和DNA損傷。為了與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)保持一致，我們還研究了氫氣對(duì)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響。通過(guò)Hoechst和PI染色結(jié)果以及流式細(xì)胞術(shù)分析，我們的研究表明氫氣處理可減少細(xì)胞凋亡并維持細(xì)胞活力，這表明氫氣可保護(hù)IEC-6免受輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷（圖5A-E）。

以往的研究表明，輻射誘導(dǎo)的ROS過(guò)度產(chǎn)生是通過(guò)線粒體通透性轉(zhuǎn)換機(jī)制放大的。由于氫在所有元素中分子量最小，因此很容易滲透到線粒體中，保護(hù)線粒體免受氧化損傷。因此，我們假設(shè)氫氣可能通過(guò)線粒體保護(hù)對(duì)輻射引起的損傷具有細(xì)胞保護(hù)作用。首先，我們目前的研究表明，氫氣可明顯緩解輻射誘導(dǎo)的線粒體去極化，并維持線粒體凋亡蛋白。此外，本研究還對(duì)涉及線粒體途徑的促凋亡分子的活性進(jìn)行了研究。

細(xì)胞色素c是一種保存完好的電子傳遞蛋白，是線粒體膜間隙呼吸鏈的一部分。在我們目前的研究中，輻射刺激導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活caspase-3、caspase-9和PARP，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。我們的研究表明，氫氣可阻止細(xì)胞色素c的釋放，并抑制caspase-9、caspase-3和PARP的過(guò)度激活。

此外，我們還研究了與線粒體凋亡途徑相關(guān)的Bax、Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)。Bax蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體是觸發(fā)死亡信號(hào)的關(guān)鍵步驟，而B(niǎo)cl-2和Bcl-xl可通過(guò)阻止細(xì)胞色素c從線粒體釋放來(lái)防止細(xì)胞凋亡。我們目前的研究還表明，氫氣能阻止Bax的表達(dá)增加，減少Bcl-xl和Bcl-2L的表達(dá)，這與之前的研究一致。所有這些研究都表明，氫氣可能由于參與阻斷線粒體凋亡途徑而發(fā)揮保護(hù)作用（圖6C、D和E）。

重要的是，我們的研究顯示氫氣的治療時(shí)間窗相對(duì)較窄。我們目前的研究提供的證據(jù)表明，一旦在輻射后30分鐘給藥，氫氣的治療效果就微乎其微，這意味著氫氣的預(yù)防效果可能比治療效果更有效。

總之，我們的研究同時(shí)證明，氫氣對(duì)輻射引起的腸道細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。在體外，我們的研究表明氫氣的保護(hù)作用與阻斷線粒體凋亡途徑有關(guān)。由于氫氣的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)與氫氣相關(guān)的抗氧化方法來(lái)治療輻射誘導(dǎo)的消化道綜合征也許是有可能的。