目的：慢性銅綠假單胞菌肺部感染是囊性纖維化（CF）患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥。CF患者受感染的支氣管內(nèi)粘液含有厭氧區(qū)，主要是由于多形核白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)。我們最近證明了銅綠假單胞菌感染患者的痰液中存在持續(xù)的反硝化作用。因此，我們的目的是研究幾種已知CF病原體的致病性是否與其反硝化能力相關(guān)。

方法：我們使用一氧化二氮(N2O)微電極測(cè)量反硝化作用，并通過吸光度變化和菌落計(jì)數(shù)對(duì)來自32名慢性感染高致病性細(xì)菌銅綠假單胞菌、木糖氧化無色桿菌、多食伯克霍爾德菌或低致病性細(xì)菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的CF患者的分離株進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)測(cè)量。估算NO3-和NO2-的消耗量，所有分離株均在含有NO3-或NO2-的厭氧LB肉湯中培養(yǎng)2天進(jìn)行測(cè)定。16S rRNA的PNA FISH染色用于估計(jì)每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的核糖體量，從而估計(jì)痰中嗜麥芽糖鏈球菌的原位生長(zhǎng)率。

結(jié)果：補(bǔ)充NO3-導(dǎo)致5銅綠假單胞菌、木糖氧化放線菌和多食芽孢桿菌產(chǎn)生N2O增加，并促進(jìn)所有病原體的生長(zhǎng)。然而，嗜麥芽糖鏈球菌的生長(zhǎng)速度最低。NO3-被所有病原體代謝，但只有銅綠假單胞菌能夠去除NO2-。通過弱PNA FISH染色可以看出，嗜麥芽糖鏈球菌在痰中的生長(zhǎng)有限。

結(jié)論：所有四種病原體都能夠通過NO3-還原進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)。然而，在嗜麥芽糖鏈球菌分離株中并未發(fā)現(xiàn)N2O產(chǎn)生所證明的反硝化作用。進(jìn)行反硝化的能力可能有助于傳染性分離株的致病性，因?yàn)橥耆聪趸龠M(jìn)更快的厭氧生長(zhǎng)。嗜麥芽糖鏈球菌無法通過反硝化作用增殖，因此無法在厭氧CF痰中生長(zhǎng)，這可能解釋了其對(duì)CF患者的低致病性。

前言:

囊性纖維化是一種常染色體隱性遺傳病，銅綠假單胞菌、木糖嗜鉻桿菌、多食伯克霍爾德氏菌和嗜麥芽窄食單胞菌等革蘭氏陰性桿菌可引起CF患者呼吸道慢性感染。銅綠假單胞菌、木糖擬單胞菌和多食單胞菌會(huì)導(dǎo)致慢性肺炎組患者在慢性感染后肺功能嚴(yán)重惡化。慢性嗜麥芽窄食單胞菌感染的肺功能惡化較慢，甚至長(zhǎng)期穩(wěn)定。

銅綠假單胞菌慢性肺部感染的主要致病菌，存在于支氣管內(nèi)粘液中被多形核白細(xì)胞(PMN)包圍的生物膜聚集體中，其中包含厭氧區(qū)。這種厭氧主要是由宿主細(xì)胞引起的，因?yàn)橹行粤＜?xì)胞為了產(chǎn)生超氧化物而強(qiáng)烈消耗氧氣，其次是產(chǎn)生一氧化氮(NO)和肺上皮呼吸，而微生物需氧呼吸消耗的氧氣很少。盡管有厭氧菌，銅綠假單胞菌仍在支氣管內(nèi)分泌物中生長(zhǎng)并持續(xù)存在。這種厭氧生長(zhǎng)提供能量的機(jī)制顯然包括反硝化作用，因?yàn)橹夤軆?nèi)分泌物中持續(xù)產(chǎn)生一氧化二氮(N2O)以及反硝化標(biāo)志物OprF porin，而且痰和氣管吸出物中的氨濃度隨著抗菌治療而降低。精氨酸發(fā)酵也可能有助于銅綠假單胞菌的生存，盡管其能量產(chǎn)量遠(yuǎn)低于好氧或無氧呼吸。在好氧生長(zhǎng)過程中也可能發(fā)生反硝化作用，盡管反硝化作用的速率與O2濃度成反比。

反硝化作用可能有利于銅綠假單胞菌的生物膜粘液表型，這種表型是慢性感染的特征，因此在CF中具有高致病性，并可能促進(jìn)生長(zhǎng)，并增加對(duì)抗生素的耐受性。因此，反硝化作用可能與慢性銅綠假單胞菌肺部感染的致病性有關(guān)。

本研究中使用的三個(gè)高致病性分離物已知有能力將NO2?還原到亞硝酸鹽(NO2?)之外，但對(duì)嗜麥芽窄食單胞菌沒有。因此，通過比較高致病性銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食桿菌、多食桿菌和低致病性嗜麥芽窄食單胞菌的反硝化作用，我們推測(cè)反硝化作用與病原菌的致病力有關(guān)。反硝化被量化為N2O的缺氧釋放，這是反硝化的標(biāo)志，在添加了N3?和NO2?的慢性感染的CF患者中分離的N2O微電極進(jìn)行了反硝化，此外，通過傳統(tǒng)的生長(zhǎng)測(cè)定方法以及新開發(fā)的PNAFISH染色技術(shù)來確定NO2?和NO2?對(duì)厭氧生長(zhǎng)的影響。

材料和方法：

病人：四種病原體的慢性感染：在痰標(biāo)本培養(yǎng)中檢測(cè)到細(xì)菌超過6個(gè)月，或在抗體反應(yīng)增強(qiáng)的情況下，在較短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到細(xì)菌的存在。

痰標(biāo)本:本研究對(duì)3例慢性嗜麥芽窄食單胞菌感染患者在放棄知情同意的情況下獲得口服許可后，取痰作常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查。

細(xì)菌:12株銅綠假單胞菌Cf分離株，9株木霉Cf分離株，9株多食桿菌Cf分離株和7株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Cf分離株.

刮取細(xì)菌被稀釋在100ml肉湯培養(yǎng)24h(150rpm，37?C)。在分光光度計(jì)中記錄OD600，50ml培養(yǎng)物在磷酸鹽緩沖鹽水中洗兩次，然后5000rpm，4?C，10min。將小球重新懸浮在5ml PBS中。實(shí)際細(xì)菌含量通過在藍(lán)色平板上電鍍0.9%氯化鈉的連續(xù)稀釋的CFU計(jì)數(shù)來估計(jì)。

媒介：用KNO3或NaNO2添加LB肉湯，以獲得10 mM的最終濃度。然后將培養(yǎng)基經(jīng)無菌過濾(0.2 L)至50ml用半透膜密封的試管中，然后置于37?C的缺氧氣氛中72h。

慢性感染CF患者細(xì)菌分離株的厭氧處理：在缺氧條件下將過夜培養(yǎng)物接種到含有10 mM KNO3或10 mM NaNO2的LB肉湯中，以達(dá)到2ml中≈106CFU/ml的最終濃度。玻璃瓶放置培養(yǎng)24和48h(150rpm，37?C)。

生長(zhǎng)測(cè)量：在測(cè)量N2O之前，將玻璃瓶放置在雙光束分光光度計(jì)中，并測(cè)量OD600。以Lb肉湯作為參照物。在N2O測(cè)量后，通過在藍(lán)色瓊脂平板上連續(xù)稀釋0.9%的氯化鈉來估計(jì)樣品的菌落形成單位(CFU)。

N2O的微傳感器測(cè)量：將玻璃瓶放置在加熱的金屬架上，保持在37?C下，用安裝在電動(dòng)PC控制輪廓裝置中的電流型N2O微型傳感器記錄N2O濃度。微傳感器(尖端直徑100m)手動(dòng)放置在樣品中。

通過在實(shí)驗(yàn)溫度和鹽度下測(cè)量不含N2O的PBS中的傳感器信號(hào)以及在PBS中順序添加已知體積的N2O不同濃度來線性校準(zhǔn)N2O微傳感器。飽和PBS中的N2O濃度是根據(jù)微量氣體計(jì)測(cè)量的N2O溶解度來估計(jì)的。

NO3?和NO2?定量測(cè)定:NO3?標(biāo)準(zhǔn)曲線用于測(cè)定總NO3?和NO2?濃度，而NO2?標(biāo)準(zhǔn)曲線用于單獨(dú)測(cè)定NO2?。NO2?濃度減去總NO3?濃度和NO2?濃度即可估算出NO3?濃度。

增長(zhǎng)率的測(cè)量：從痰中分離出的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在37?C的LB發(fā)酵液中獲得了純培養(yǎng)生長(zhǎng)率。將過夜的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌培養(yǎng)物稀釋到250ml燒瓶中的100mlLB肉湯中，在200rpm至OD600=0.05時(shí)，允許培養(yǎng)物增殖(37?C，200rpm)。當(dāng)OD600達(dá)到0.5時(shí)，培養(yǎng)物被稀釋到OD600為0.05，通過監(jiān)測(cè)OD600隨時(shí)間的變化來測(cè)量后增長(zhǎng)率。生長(zhǎng)率用比生長(zhǎng)率(每小時(shí)數(shù))表示。

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的固定化：將分離的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌L固定在一滴固定液中，混合在顯微鏡載玻片上。固定細(xì)胞在65?C下，在數(shù)字干浴上孵育20分鐘。將咳出的痰固定在一次性乙烯基樣模中。固定樣品用?80?C己烷(SIGMA)快速冷凍。

痰標(biāo)本的冰凍切片：將快速冷凍的塊在?18?C低溫恒溫器上切成8um厚的切片。切片固定在顯微鏡載玻片上。

全細(xì)胞雜交：將一滴嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的探針加到固定的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的玻片上，蓋上22 mm×22 mm的蓋片，55?C孵育90min，然后在4ml60×洗滌液中孵育30min，洗滌液稀釋到240mlMilliq H2O中，然后在黑暗中風(fēng)干15min。此外，對(duì)于痰標(biāo)本，加入100 L Syto 59(Invitgen)1000×氯化鈉溶液進(jìn)行染色，然后孵育15min，然后進(jìn)行PBS漂洗和黑暗中風(fēng)干。在幻燈片上加一滴硬質(zhì)安裝介質(zhì)，用蓋片密封，風(fēng)干10分鐘。

顯微技術(shù)和圖像分析:用蔡司顯微鏡以及隨附的蔡司軟件掃描安裝的樣品載玻片。熒光成像采用63×1.4油物鏡，使用免費(fèi)軟件Image J(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的熒光進(jìn)行量化。細(xì)胞和背景信號(hào)之間的區(qū)別是通過使用圖像J的自動(dòng)“多閾值”宏閾值來完成的。為了定量，使用了Image J函數(shù)“分析粒子”。對(duì)于每個(gè)被分析的菌株，我們使用17,000平均熒光強(qiáng)度單位作為區(qū)分生長(zhǎng)和不生長(zhǎng)的最低檢測(cè)下限。